2 - Kultivierung von Mikroorganismen

1. Konsistenz

2. Zusammensetzung

3. Verwedungszweck

- Konsistenz: flüssig oder fest

- Flüssige Nährmedien (auch Anreichuerungsmedien genannt) die für folgende Sachen dienen:

- Bakterien anzureichern

- Bei Reinkulturen zur Prüfung physiologischer Eigenschaften

- Zur Gewinnung grösser Zellmengen

- Feste Nährmedien (auch Isolierungsmedien ganannt) werden eingesetzt für:

- Keimzahlbestimmung

- Gewinnung, Überprüfung und Aufbewahrung von Reinkulturen

Die flüssigen Nährmedien sind Nährlösungen die durch die Zugabe von Agar (12-20 g/l) oder Gelatine (30-150 g/l) in feste Form gebracht werden. Agar (maaliisch Agar-Agar) wird aus Rotalgen extrahiert und anschliessend aufgereinigt, so dass er für die Mikrobiologie eingesetzt werden kann.

Zusammensetzung: komplexe oder synthetische Nährmedien

- Ein synthetisches Medium enthält ausschliesslich chemisch exakt definierte Bestandteile in bekannter Konzentration (Zucker, Stärke, Alkohole, Fettsäuren usw. und Stickstoffquellen wie Ammoniumverbindungen, Aminosäuren und Nitrat).

- In einem Komplexnährboden sind ein oder mehrere organische Bestandteile enthalten, deren chemische Zusammensetzung nicht genau bestimmt ist, meist komplexe, schlecht definierte Naturprodukte wie Hefeextrakt, oder Pepton. Diese Bestandteile dienen als Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und puffern durch ihren Peptid- und Aminosäuregehalt das Medium relativ gut ab. Zudem enthalten sie in der Regel genügend Spurenelemente und Vitamine. In diesen komplexen Medien wachsen die meisten Mikroorganismen.

Für stoffwechselphysiologische Untersuchungen benötigt man in der Regel synthetische Nährböden.

- Enthält ein synthetisches Nährmedium nur die für das Wachstum des betreffenden Organismus unbedingt notwendigen Stoffe (das „Existenzminimun“), so spricht man von einem Minimalmedium. Die Entwicklung eines Minimalmediums setzt voraus, dass die Nährstoffansprüche des Organismus genau bekannt sind.

- Ein Vollmedium enthält dagegen noch weitere Verbindungen, die nicht unbedingt lebensnotwendig sind, das Wachstum jedoch fördern. Ein komplexer Nährboden ist immer ein Vollmedium.

Universalnährmedium , Selektivnährmedien, Differenzialnährmedium

Das Universalmedium ist ein Komplexmedium, das für das Wachstum einer Vielzahl von Mikroorganismen geeignet ist.

Selektivenährmedien (auch als Elektivennährmedien bezeichnet) enthalten selektive Zusätze, die möglichst nur eine Mikroorganismengattung oder Mikroorganismenart vermehren lässt und andere Keime hemmt. Sie können in flüssiger Form (selektives Anreicherungsmedium) oder in fester oder halbfester Form (selektives Isolierungsmedium) eingesetzt werden.

(Indikatornährböden) enthalten Zusätze, z.B. Farbstoffe, die bestimmte, diagnostisch wichtige Stoffwechselleistungen von Mikroorganismen sichtbar machen, indem sie mit Stoffwechselprodukten reagieren, die in diesem Medien nur von bestimmten Organismen gebildet werden. Dabei kann es zu einer Veränderung (z. B. Verfärbung) des Mediums oder der Kolonie kommen.

- Bouillonkultur: Anzucht in einem flüssigen “Allgemein-Medium”.

- Agarschrägkultur : Anzucht auf der Agaroberfläche eines Agar-Schrägröhrchens.

- Stichkultur: Kultur in einem festen oder halbfesten Agarmedium in einem Reagenzglas, Beimpfung durch Stich mit der Impfnadel.

- Schüttelkultur: Kultur in einem flüssigen Medium, Bebrütung unter Schütteln.

- Plattenausstrich: Kultur auf der Oberfläche eines festen Agarmediums.

- Gusskultur: Kultur in einem festen Agarmedium durch Vermischen der Probe mit dem

noch flüssigen Agar.

- Flüssig-flüssig mit der Oese

- Fest - flüssig mit der Oese

- Fest-fest oder flüssig-fest mit der Oese

1. Material:

In einem Reagenzglasgestell stehen ein Reagenzglas mit Impfmaterial (Bakterienkultur) und ein Reagenzglas mit steriler Nährlösung bereit. Die Reagenzien werden beschriftet. Bakterienkultur durch Schütteln (Vortex-Mischer) gut mischen.

2. Ausglühen der Impföse: (nicht nötig wenn man mit Einwegöse arbeitet):

Impföse mit der rechten Hand schräg nach unten halten und dabei die ganze Länge der Impföse im heissen Teil der Flamme (über dem inneren Kegel) ausglühen. Den Metallteil des Ösenhalters nur kurz durch die Flamme ziehen. Impföse abkühlen lassen.

3. Entnahme des Impfgutes:

Reagenzglas mit der Bakterienkultur in der linken Hand halten, mit der rechten Hand (hält bereits die Impföse!) zwischen Kleinfinger und Handballen, den Stopfen oder die Metallkappe entfernen und festhalten. Die Öffnung des Reagenzglases durch die Flamme ziehen. Mit der ausgekühlten Impföse in die Kulturlösung tauchen, wobei darauf zu achten ist, dass die Impföse nicht an der Öffnung oder Aussenwand des Reagenzglases anstösst. Eine Flüssigkeitshaut muss in der Öse ausgespannt sein . Reagenzglas mit der Öffnung durch die Flamme ziehen, schliessen und ins Gestell zurückstellen.

4. Einbringen des Impfgutes in die sterile Nährlösung:

Reagenzglas mit der sterilen Nährlösung in der linken Hand halten und Stopfen in beschriebener Art mit der rechten Hand öffnen. Die Impföse in die Nährlösung einführen und leicht schwenken. Reagenzglas mit der Öffnung durch die Flamme ziehen, schliessen und ins Gestell zurückstellen.

5. Impföse ausglühen, bevor sie in den Ösenhalter zurückgestellt wird

1. Beschriftung der zu beimpfenden Nährlösung (im RG)

2. Ausglühen der Impföse (nicht nötig wenn man mit Einwegöse arbeitet)

3. Entnahme des Impfgutes:

Schrägagar-Röhrchen öffnen (Deckel wird mit dem rechten kleinen Finger wie beschrieben gehalten) und abflammen. Impföse vorsichtig einführen, leicht über die Bakterienkultur fahren und etwas Bakterienmasse entnehmen. Röhrchen mit der Öffnung durch die Flamme ziehen, schliessen und ins Gestell zurückstellen.

4. Einbringen des Impfgutes in die sterile Nährlösung:

Wie vorgängig beschrieben, wobei die Bakterienmasse an der inneren Wand des RG in Höhe des Flüssigkeitsspiegels zunächst leicht verrieben und dann in der Flüssigkeit aufgeschwemmt wird.

5. Ausglühen der Impföse.

1. Beschriftung des Schrägagar-Röhrchens.

2. Ausglühen der Impföse.

3. Entnahme des Impfgutes (von einer Platte oder RG).

4. Anlage der Schrägagar-Kultur:

Schrägagar-Röhrchen öffnen und durch die Flamme ziehen. Impföse bis zum unteren Ende der Schrägfläche einführen (sollte Flüssigkeitstropfen enthalten, sonst ist das Schrägröhrchen alt und ausgetrocknet). Bakterienmasse von unten aus dem Flüssigkeitstropfen heraus in einer Wellenlinie leicht auf der Agaroberfläche abstreifen, dabei keine Furchen graben, sondern nur leicht über die Oberfläche gleiten. Schrägröhrchen abflammen und schliessen. Ausglühen der Impföse.

- BHI-Bouillon - flüssige Nährmedien

- PC-Agar - feste Nährmedien

Züchtung

Mikroorganismen lassen sich in verschiedensten Kulturmedien und bei unterschiedlichsten Bedingungen züchten. Im Folgenden werden verschiedene Medien, die sich zur Züchtung von bestimmten Mikroorganismen eignen, besprochen.

- Bouillonkultur: Anzucht in einem flüssigen “Allgemein-Medium”.

- Agarschrägkultur: Anzucht auf der Agaroberfläche eines Agar-Schrägröhrchens.

- Stichkultur: Kultur in einem festen oder halbfesten Agarmedium in einem Reagenzglas, Beimpfung durch Stich mit der Impfnadel.

- Schüttelkultur: Kultur in einem flüssigen Medium, Bebrütung unter Schütteln.

- Plattenausstrich: Kultur auf der Oberfläche eines festen Agarmediums.

- Gusskultur: Kultur in einem festen Agarmedium durch Vermischen der Probe mit dem noch flüssigen Agar.

Aufbewahrung

- Schrägagarkulturen: Reagenzgläser mit Schrägagar, verschlossen mit einem Schraubverschluss (mit Dichtung!) oder dichtsitzendem Gummistopfen, um die Gefahr einer Austrocknung der Kultur möglichst gering zu halten. Wattestopfen sind für die Lagerung ungeeignet! Zur Aufbewahrung von Schimmelpilzen als Schrägagar-Kultur empfiehlt sich das Überschichten mit sterilem Paraffin.

- Agarstichkultur: Agarmedium in einem Reagenzglas, Stichkultur, eventuell Aufbewahrung unter Paraffin.

- Bouillonkultur: Nur für bestimmte Bakterien z.B. Milchsäurebakterien geeignet. Es empfiehlt sich Cooked Meat Medium. Bei Anaerobiern wird die Flüssigkultur mit sterilem Paraffin überschichtet.

- Konservierung unter Paraffinöl: Für die längerfristige Konservierung können Bakterienkulturen mit Parafinöl vermischt und eingefroren werden. Wobei das Paraffinöl als Schutzmittel gegen die Kälte eingesetzt wird.

Reinigung Drei-Ösen-Ausstrich

1. Beschriftung der Nährbodenplatte (auf dem Boden). Der Nährboden sollte gut angetrocknet sein und es sollte kein Kondenswasser in der Nährbodenplatte sein.

2. Ausglühen der Impföse.

3. Entnahme von Bakterienmaterial:

Etwas Bakterienmaterial (von einer Flüssigkultur; falls nur eine feste Kultur zur Verfügungsteht, nur wenig Bakterienmasse entnehmen) mit der Impföse entnehmen, die Bakterienmasse sollte an der Impföse makroskopisch kaum sichtbar sein.

4. Ausstreichen der Bakterienmasse:

Das entnommene Bakterienmaterial auf einem Viertel des Nährbodens in zwei bis drei parallelen Strichen vorsichtig ausstreichen (die Öse muss flach über den Agar geführt werden, damit keine Furchen entstehen). Im pföse ausglühen und mit der ausgekühlten Öse aus den vorhandenen Parallelstrichen in einem 90-Grad-Winkel, wie abgebildet, erneut Bakterienmasse in zwei bis drei Strichen ausstreichen. Vorgang noch ein- bis zweimal wiederholen (3 bis 4 Ausstrichsserien).