Zellkultur

Kammerbasierte optische Systeme (NC3000): Zellen werden gefärbt und dann optisch mittels Einwegzählkammern gezählt / Automatisierte Zellzählung (Zen Cell Owl): Keine Färbung nötig - Lebend-Mikroskopie - in bestimmten Intervallen werden Fotos gemacht

Elektrisch basierte Zellzählung über Widerstandsmessung (CASY) / Durchflusscytometer

Probe wird über Messkapillare angesaugt an die eine Spannung angelegt ist - Widerstand wird erhöht wenn Zelle durch die Kapilare geht - Pulsfläche ist dem Zellvolumen und der Zellmembrandurchlässigkeit proportional

1. Peak bei geringem Widerstand: Debris / 2. Peak bei mittlerem Widerstand: tote Zellen mit nicht intakter Membran / Peak bei hohem Widerstand: große vitale Zellen

Zellen werden mit Lichtstrahlen(Lasern) gemessen

Zellvolumen (über Lichtbeugung/Forward Scatter) / Struktur der Zellmembran und intrazelluläre Bestandteile -Granularität (über Lichtstreuung Sidewards Scatter) / Färbeintensitäten(Antikörper/endogene Expression) (durch Messung der Fluoreszenz)

Lichtquelle/ Durchflussmesszelle/Filter/Detektoren/Komputer

Zellen einer Einzelzellsuspension werden durch hydrodynamische Fokussierung wie an einer Perlenkette an einem gebündelten Laserstrahl vorbeigeleitet / Streulicht oder Fluoreszenz wir durch Photodetektoren registriert und über den Computer verrechnet / Darstellung: Verteilung von Intensitäten

FACS (fluorescene activated cell sorting/ Sortierung der Zellen im elektrischen Feld)

mit Fluoreszenzfarbstoff-markierten Antikörpern die an die Moleküle binden

Medizinische Diagnostik / Zellbiologische Grundlagenforschung / Lebensmittelanalytik (Keimzahlbestimmung in Rohmilch)

Zellzyklus und Apoptose-Assyas (Färbung mit RNA/DNA Farbstofefen (DAPI/PI)) / Fluoreszenzfarbstoffe die eine Anayse des intrazellulären pH-Wertes und des Ionfluss an Zellmembranen erlauben / Einsatz von Farbstoffen die direkt von den Zellen produziert werden (GFP / mCherry)

LDH-Test: Messung der Lactat-Dehydrogenase Aktivitätim Medium (anaerobe Stoffwechsel) - Messprinzip: Zellmembranpermeabilität - geschädigte Zellen setzen LDH frei - LDH reduziert NAD zu NADH - NADH-Konzentration wird photometrisch gemessen (Anwendung bei Zytotoxizitätstest/ gut geeignet für hohen Probendurchsatz mit adhärenten Zellen / Vitalitätsbestimmung mit WST-1: Messprinzip: Colorimetrisch-basierte Messung der metabolischen Aktivität: WST-1 (gelb) wird in vitalen Zellen zu Formazan (orange) reduziert - photometrische Messung

CellTiter-Glo: Messprinzip: Quantifizierung von ATP durch Biolumineszenz (Luciferin+ATP+O2 wird durch Luciferase in Oxyluciferin unter Lichtbildung umgewandelt) / Messung erfolgt mittels Luminometer / ATP-Gehalt ist proportional zur Viabilität

Colony forming assaybasiert auf der Eigenschaft das vitale Zellen zu einer Kolonie heranswachsen können / Zellen werden dünn ausgesät - 1-3 Wochen inkubiert - fixiert -gefärbt (Kristallviolett) -gezählt / Einsatz: Test der dosisabhängigen Überlebensrate b

2^n = 16

Generationszahl n: Anzahl der Verdopplungen (Formel: (log (Nt=Zellzahl zum Zeitpunkt t)-log(N0=Anfangszellzahl))/log(2)) / Verdopplungszeit(Gerenerationszeit g) tg: Zeit für die Verdopplung der Zellmasse/Zellzahl einer Population während der log-Phase (Formel: delta t/n oder ln(2)/mü) / Teilungsrate v: Anzahl der Verdopplungen pro Stunde (Formel: 1/tg oder mü/ln(2)) / Spezifische Wachstumsrate (spez. Teilungsrate) mü: Zunahme der Zellzahl pro Zeiteinheit (Steigung der Tangente an der Kurve in halblogarithmischer Darstellung)(Formel: mü=(ln(Nt)-ln(N0))/delta t

1. Anlaufphase (lag-Phase): Adaption der Zellen an neue Bedingungen - Zeit von Aussaat bis zum Erreichen der maximalen Teilungsrate / 2. Beschleunigungsphase: Zellteilung setzt ein / 3. Exponentielle Phase (LogPhase): maximale Teilungsrate der Zellen Zellzahl nimmt pro Zeiteinheit um konstanten Faktor mü zu - hoher Substratverbrauch und Anreicherung von toxischen Metaboliten / 4. Übergangsphase: Zeitabschnitt zwischen log Phase und Plateau Phase - abnehmende Teilungsrate / 5. verzögertes Wachstum es entstehen so viele neue Zellen wie Zellen sterben - Produktion des rekombinanten Produkts - Metabolic switch mit Remetabolisierung von Nebenprodukten (Lactat/Ammonium) - Kontaktinhibition / 6. Übergangsphase: Teilungsrate wird kleiner als Absterberate / 7. Abnahme der vitalen Zellzahl (Autolyse durch zelleigene Enzyme) - meistens kritische Konzentration von toxischen Nebenprodukten - Substratlimitation -meist (negative) Veränderung der Produktqualität

Phasen (Wachstumskurve oder Zellzyklusphasen) / spezifische kinetische Parameter (z. B. Wachstumsraten/Produktbildungsraten) / Konzentrationen (Zellen/Nährstoffe/Metabolite/Produkte)

Zellzahl (quantitativ) / Zellmasse (quantitativ) /Konfluenz (qualitativ)

Zählkammer / Ausplattieren und Kolonien zählen

9 Großquadrate / 0,9µm

Zellzahl/ml = Mittelwert der vier Großquadrate*10.000 (Kammerfaktor)

20 - 50

weniger als 20 Zellen pro Großquadrat / Fehler beim Verdünnen/Pipettieren / Einschätzung was eine Zelle ist

nur tote Zellen werden gefärbt

Ausschlusfärbung: Trypanblau und Erythrosin B / Lebendfärbung: Neutralrot

Proteine werden gefärbt / toxische Wirkung

es wird durch Endozytose aufgenommen und in Lysosomen gespeichert / 3 Stunden Inkubationszeit