MeMi 2 Molekularbiologie

Zucker + Phosphat-Base 

DNA (Desoxyribose)
RNA (Ribose)

A-T (U)
G-C

Prokaryoten: 4200 Gene, 1 Plasmid (90% codiert für Proteine)

Eukaryoten: 30'000 Gene (Nukleus und Mitochondrien), (1.5% codiert für Proteine, Rest Kontroll DNA-> Enhancer, Silencer)?

Welche Grene hoch/runter reguliert sind unter welchen Bedingungen
 

(Modellorganismen zb Hefe, Maus, E.coli)

Replikation (für Zellteilung) während S-Phase (dauer ca 8h)

DNA -Transkription- RNA -Translation- Protein

Zellteilung mit Mitose ist nur bei somatische Zellen 

1. Initation
Start beim Replikationsursprung
Entspiralisierung (Topoisomerase)
Aufteilung (Helicase bricht H-Brücken, Proteine binden an Einzelstränge zur stabiliserung)
Primer (Primase erstellt RNA Primer und bringt sie an 3'Ende)

2. Elongation
Synthese ( DNA Polymerase bindet Nukleotide am 3' Ende der Primer (arbeitet 5'->3')
Leitstrang direkt, Folgestrang mit Okazaki Fragmente Lücken schliessen)
Primer entfernt
Polymerase füllt Primerlücken
Ligase zur Lückenschliessung

3.Termination
Replikation endet beim Erreichen der Enden (Eukarytone)
Beim Ringförmigen Genom gibts eine Replikationsterminationsstelle (Prokaryoten)

bei ncbi Sequenz suchen und kopieren
gewünschte Sequenz Bereich markieren
Foreward und Reverse Primer designen in ncbi

wichtig: an 3'Ende C oder G
40-60% GC Gehalt
keine Selbst-Komplementarität (unregelmässige verteiling und der Basen und daher selbst entstehen verbindungen)

Die Ursprungs-DNA (die Originale) jeweils zur Hälfte an die Tochterzellen weitergegeben werden und somit stets nur zur Hälfte «konserviert» bleiben

DNA Polymerase, 5’ -> 3’

(erkennt ungepaarte Primer Enden)

Am Leitstrang synthetisiert die DNA Polymerase kontinuierlich den neuen Strang. Am Folgestrang «folgt» sie indem sie von Okazaki zu Okazaki Fragment «hüpft» (diskontinuierliche Synthese).

Okazakifragment: DNA von 100-200Nukleotide

Synthetisiert Primer an Leit- und Folgestrang

(10 Nukleotide lang)

Verknüpft Okazaki Fragmente nach dem der Primer ersetz wurde

Kontinuität: am Leitstrang läuft die Synthese kontinuierlich von 5’->3’, am Folgestrang diskontinuierlich.

Synthetisierter Strang: am Leistrang an einem Stück, am Folgestrang in Fragmenten die legiert werden müssen.

Anzahl Primer: 1 Primer am Leitstrang zu Beginn, beim Folgestrang werden ständig Primer angelegt um die Okazaki Fragmentsynthese zu gewährleisten

Aufbrechen der H-Brücken

Stabilisiert Einzelsträngige Matrize der DNA

unterstützt die DNA-Polymerase bei der Synthese damit sie nicht von der Matrize runter fällt

(Proteine die sich wie ein Schutzring um die Polymerase legen und sie an der Matrize halten. Sie geben die Polymerase frei sobald sie das Okazaki Fragment fertig hat. Beim Leitstrang bleibt die PCNA dran und «fährt» mit der DNA Polymerase stets mit)

erkennt und korrigiert Fehler (beim neuen Strang)

vergl. Verzerrungen in der Helix -> wird von Polymerase nicht erkannt

1. Das Enzym MutL erkennt den neuen Strang

2. Ein anderes Enzym, MutS, schneidet die fehlgepaarte Base aus

3. Die korrekte Base wird eingefügt

1. Korrektur am DNA Folgestrang: Folgestrang hat Brüche (da er Lücken hat zwischen Okazakis), diese verursachen «Knicks» im Doppelstrang und «locken» mit dieser Knick-Struktur das eukarotische Korrektursystem an.

2. Korrektur am DNA Leitstrang: wird vermutlich «gebrochen» und dann korrigiert

Topoisomerase verhindert Torsionsspannung  (Überdrehung)

Topoisomerase I: Einzelstrangbruch kurz vor Replikationsgabel

Topoisomerase II: Doppelstrangbruch durch kovalente bindung beider Stränge 

am Replikationsursprung 

(reich an AT (leicht aufzubrechen da nur 2 H-Brücken)

hat 1 ein Replikationsursprung 

1. Initiatorproteine binden an den Ursprung und destabilisieren den AT reichen Bereich.
2. Die Helikasen werden auf die DNA geladen und aktiviert.
3. Die Primase wird auf die DNA geladen und synthetisiert die Primer.
4. Die DNA-Polymerase wird auf beide Stränge geladen (Folge- und Leitstrang)

Replikationsgeschwindigkeit: 1000 NTd pro Sekunde

alle 30000-5000 Nukleotide gibt es einen Ursprung (Chromosmen sind riesig!)

1. Damit die Replikation nicht der Transkription in den Weg kommt, denn diese läuft parallel zur Replikation. Das bedeutet, wenn die Transkription an einer Stelle im Chromosom gerade läuft, dann hat die Zelle die Möglichkeit in der Nähe einen Replikationsursprung zu suchen und die Replikation zu starten und muss nicht auf die Transkription warten. Die Replikation wird dennoch auch immer in der Nähe der Transkription gestartet da dort das Chromatin schon aufgelockert und besser zugänglich ist.

2. Der Stopp erfolgt wenn zwei Replikationsgabeln aufeinander treffen, der Replikationskomplex fällt dann einfach von den Strängen ab

S-Phase

dauer 8h -> nur immer Pakete von 50 Replikationsursprüngen starten

Es wird zwischen Euchromatin (locker, hier läuft die Transkription eines Gens) und Heterochromatin (kompakt verpackte DNA) unterschieden. Die Reihenfolge ist vermutlich von der Chromatinstruktur abhängig; d.h. die ersten Replikationen starten dort wo das Chromatin gerade locker ist und die Ursprünge leichter zugänglich sind. Deswegen wird das Heterochromatin immer zuletzt repliziert weil es erst noch gelockert werden muss. 

Bindungsstelle für ORC Komplex und mind. eine für Proteine die ORC anlocken

reich an A/T

 1. Während der G1-Phase werden die replikativen Helikasen auf die DNA die am nächsten zum ORC Komplex ist (ORC, engl. origin recognition complex) geladen = präreplikativer Komplex

2. Bei Übergang von G1 zu S Phase aktivieren Proteinkinasen die Helikasen

3. Proteinkinasen blockieren den ORC durch Phosphorylierung. So kann er keine neuen Helikasen mehr akzeptieren

Hinter Replikationsgabel -> verpacken dort neu synthetisierte DNA

repliziert die Chromosomenenden (Schutzmechanismus) ->sonst werden Chromosomenenden mit jeder Replikation (Zellteilung) gekürzt

Nukleosom verpacken DNA erst wenn neues Okazaki Fragment ca 200NTd daher auch Nukleosomen) fertig ist

Genaktivität

Genexpression

-Transkription (Initation, Elongation, Termination)

-Export aus Zellkern

-Translation  (Initation, Elongation, Termination)

-Proteinfaltung oder Abbau

Replikation
DNA Polymerase
wenig Fehler -> Vererbung Mutationen
Ganzes Genom 1x kopiert

Translation
RNA Polymerase
1/10000bp Fehler
nur Abschnitte werden x-Fach kopiert

2 Eingänge: NTds, dsDNA

1 Ausgang mRNA

Mg2+ im aktiven Zentrum

TF (Transkriptionsfaktor)
 

TATA-Box (DNA Sequenz) -> wird von TF erkannt

Initation durch RNA Polymerase II

(Promoterstruktur ist nicht nur aus TATA)

Introns (nicht-codierend) werden entfernt - es bleiben nur noch die Exon übrig bei der gespleissten mRNA

1. normale abfolge
2. ein Exon übersprungen
3. ein Exon erweitert
4. Intron beibehalten
5. alternative Exons

Direkt: Probe direkt auf Platte, Antikörper gekoppelt der direkt mit Probe bindet (viel unspez. Bindungen)

Indirekt: Antikörper Nachweisen - Antigen auf Platte geben, Probe (Antikörper) dazu geben, Antikörper gegen Antikörper aus Probe geben direkt gekoppelt oder über weiteren Antikörper gekoppelt 

Sandwich: Antikörper auf Platte, Probe bindet daran, Sekundärer Antikörper mit Kopplung bindet an Probe (noch weiterer Antikörper gegen Sekundär Antikörper (gute Signalstärke, oft in Diagnostik))

Kompetitive: Antigen Nachweisen - Antikörper auf Platte, Probe (Antigrn) mischen mit konjugierten Antigen und gegen die konjugierten Antigene bindet dann an Antikörper  (kleine Moleküle, Homone,..)