HiZy 1

1. Einsenderichtlinien
2. Vorbehandlung (Aufschneiden,..)
3. Fixiermittel (Formalin), gekühlt und nativ
4. Menge Fixiermittel und Einsendegefäss
5. Etiketten auf Probegefäss, Einsendeschein
6. Probetransport (Zeit, Temp, Feuchtigkeit) - Schnellschnitt (Kurier,Rohrpost) innert 20min
 

-Schnellschnitt
-Immunhistochemie
-Zellen aus Gewebe gezüchtet werden sollen
-Enzymaktivität soll nachgeweisen werden
-RNA Nachweis
-DNA gewinnung
-spezielle Fixierung
-Präparat zugross

Informiert über Vorbehandlung (Geöffnet, Eingeschnitten, Fixiermittel, Menge und Gefäss, Etikette)

Informiert über Anmeldung und Ansprechpartner

Hämatoxylin-Eosin Färbung HE
Papanicolaou-Färbung PAP
Giemsa
Pappenheim-Färbung MGG
Elastica-van Gleson EvG
Goldner
Periodsäure-Schiff-Reaktion PAS
Berliner Blau Fe
Kongorot
Von Kossa
Ziehl-Neelsen

Zell und Gewebestruktur zu erhalten

Anforderung Fixiermittel: Autolyse, Fäulnis, Verwesung stoppen
Struktur und Zellkomponenten erhalten/nachweisen von Inhaltsstoffen
Gewebe durchdringen und härten
reproduzierbar

Phosphatgepuffertes Formalin -> routine Fixierung

Bouinsche Lösung -> Gewebe mit anschliessender Trichrom-Färbung

1.Zuschnitt
     a.Fixieren, Einbetten
     b.Freezing
2. Schneiden
3. Färbung
4. Eindeckeln
5. Beurteilung/Archivierung

Zuschnitt - Fixierung - Entkalkung

> entscheidend für die Qualität der Gewebemorphologie und Färbung

Zuschnitt: vorsichtig, nicht austrocknen!!, anpassen auf Histokasette, Behälter 20x grösser Wählen

Fixierung: bewahrt Zellen, stoppt degenerativer Prozess und bakterielle Zersetzung, Schützt;  Probe max. 4mm dick, 20:1 Fixiermittel:Gewebe,  Fixierzeit beachten, Qualität Fixiermittel

Entkalkung: weichmachen um Paraffinblock schneiden zu können, zu lange zerstört Morphologie, zu wenig erschwert das Schneiden, EDTA bei IHC und ISH Assay, 

Zweck: Wasser in Gewebe mit Medium  ersetzten

Prozess: Wasser mit Alkohol ersetzten, Xylol löst Alkohol, Paraffin ersetzt Xylol

1. Entwässerung (in Alkohol ziehen 70-100% aufsteigend)
2. Klärung (zwischenlösung da Alkohol und Paraffin nicht mischbar sind, 
3. Infiltration

Dehydrants (Ethyl, Methyl, Isopropyl, Butyl, Aceton)

Solvents (Xylen, Toluol, Benzen, Chloroform, Limonen, Aliphatic)

Infiltration Media (Gelatine, Resins, Paraffin)

Schnittdicke für Lichtmikroskopie: 1-10um (0.5-60um)

Schnittdicke für Elektronenmikroskopie: 0.5um-50-80nm 

Schlittenmikrotom

Rotationsmikrotom

Schliffart A - stark plankonkav (für weiches oder geschäumtes Material)

Schliffart B - plankonkav (für härteres Material, uneingebettet, frisch)

Schliffart C - keilförmig (härteres Material, Allgebrauchsmesser für Paraffinarbeit)

Schliffart D - hobelmesserförmig (härteres Material, sehr stabil)

Parafinschnitte: Einmalklinge aus Wolframkarbidstahl

für Elektronenmikroskopie: Diamantmesser, Glasmesser

- hochwertige Klingen verwenden (feine Linien in Schnitt)
- Neigungswinkel je Mikrotom anpassen (Stauchung, Plisse bildung)
- Blöcke vorsichtig trimmen (Löcher und Fragmente herausgerissen)
- Gefrierschäden vermeiden (rissig)
- Blöcke immer kalt beim Schneiden (Verzerrung)
- Gleichmässig, langsam Schneiden (Rattermuster)
- Wasserbad regelnässig wechseln (Kontaminationen)
- saubere Objektträger (Kontaminationen)
- Wasseroberfläche zwischen Blöcken abschöpfen (Kreuzkontamination vermeiden)
- Kein eigenes Körpermaterial auf Schnitt (Huatschuppen, Haare,..)
- nie gleichzeitig versch. Schnitte bearbeiten (Verwechlung)
- Wassertemp. 4-5° unter Schmeltpnkt von Wachs (Wachs schmilzt)
- Schnitt im Wasserbad glätten (Faltenbildung vermeiden)
- lang genug im Wasserbad (zu lange im Wasser führt zu Ausdehnung und Schädigung)
- Vorsichtig mit Pinsel/Pinzette glätten (Schäden vermeiden)
- 1.2. Schnitt verwerfen
- keine Luftblasen (Risse)
- adhäsive, +geladene Objektträger und Haftstoffe (ablösen vermeiden)
- Schnitte abtropfen  (unscharfe bereiche)
- Trocknungstemperatur überwachen (Zellkernschmelze)
- Trocknungszeit (Risse)

Schneiden von gefrorenem nativen oder fixiertem Gewebe ohne vorherige Infiltration mit Paraffin. Der gefrorene Zustand ermöglicht eine schneidbare Härte. Der Prozess an sich vermeidet entweder Aldehydfixierung und nachfolgende Entwässerung mit organischen Lösungsmitteln, bzw. die Entwässerung.

Vorteile: 
- sehr Schnell (Schnellschnittdiagnostik)
- Schont Antigene (bleiben für Antikörper erkennbar)
- Schont Enzyme (bleiben histochemisch nachweisbar)

Nachtei: Morphologie (Erhaltung) der Strukturen nicht so gut wie bei fixierten und paraffin-infiltrierten Geweben

schnell (Eiskristalle vermeiden)

Formulierung aus 10,24% Polyvinylalkohol, 4,26% Polyethylenglykol und 85,5% nicht reaktiven Inhaltsstoffen (wasserlöslich)
Kann zwischen -10° und -80°C eingefroren werden 

-In Flüssigstickstoff , besser in der Gasphase (-196° C)
-In schmelzendem Isopentan (kristallisiert in einem Temperaturbereich zwischen -161 und -159 ° C.)
-Auf Kohlensäureschnee (Trockeneis)  - 80

•Für einen Überblick über das gesamte Gewebe, Strukturen, Zellverteilung, Kern-Plasma-Reaktionen und die Anfärbbarkeit zu erhalten

•Bestehen aus Kernfärbung und Zytoplasmafärbung

•Zur Darstellung und Identifikation bestimmter Strukturen

•Bestehen aus Substratfärbung und Gegenfärbung

•Gegenfärbung = kann eine Kernfärbung oder allgemeine Hintergrundfärbung sein und erhöht den Kontrast

Regressive Färbung = Überfärbung der Strukturen durch einen Farbstoff im Überschuss  und die nachfolgende Differenzierung
•Dabei wird der überschüssige Farbstoff bis zum gewünschten Ergebnis wieder herausgelöst 

Progressive Färbung = Einwirken des Farbstoffs über eine bestimmte Dauer bis gewünschte Intensität erreicht ist
•Dazu werden verdünnte Färbstofflösungen verwendet
Dauer wird je nach Gewebe empirisch ermittelt 

Überfärbung mittels einem Farbstoff ist nicht möglich aufgrund seiner Spezifität, sodass sich das Färbeergebnis nach einer gewissen Zeit nicht mehr ändert

Verwendung von verschiedenen Farbstoffen gleichzeitig

Verwendung von verschiedenen Farbstoffen hintereinander (zb HE Färbung)

Erfolgt die Bindung  des Farbstoffs ohne Zusätze (Beize) an das Substrat

Bindung des Farbstoffs erfolgt mittels Beizmittel, die gleichzeitig oder nacheinander aufgebracht werden

Lösung, die das Objekt für die Färbung aufbereitet, d.h. die reagiblen Gruppen zur Verbindung mit dem Farbstoff freisetzt

-> Beim Färben bilden sich dann Metallkomplexe (Farblacke)

•Beizittel:
Metallsäuren als Oxydationsmittel (Chromsäure, Phosphormolybdänsäure)
Oxidationsfördende Substanzen (Pikrinsäure, Anilin, Phenol)
Alaunsalze (Chromalaun, Kaliumaluminiumalaun)

Anlagerung von Metallionen an das Substrat  (Silber und Goldfärbungen)

Um das Färbeergebnis haltbar zu machen, findet anschliessend eine Fixierung mit Natriumthiosulfat statt

•Hier bewirken die im Gewebe enthaltenen Enzyme die Umsetzung eines angeborenen, farblosen Substrats in ein farbiges Endprodukt, dass am Reaktionsort präzipitiert

"Routinefärbung" ->häufigste Art der Färbung von Gewebeproben 

(schnelle und relativ kostengünstige)

•Hämatein muss oxidiert werden -> Zugabe von chemischen Oxidationsmitteln und Reifung an Luft (Hämatoxylin reift im Laufe seines Lebens)

•mit "Beizmittel" (Aluminiumionen), komplexieren --> um mit dem Gewebe verbinden

•Hämatoxylin im Komplex mit Aluminium ist positiv geladen und kann mit negativ geladenen Zellbestandteilen, wie den Nukleinsäuren im Zellkern, reagieren à diese färben sich daraufhin blau - Al Komplex mit Hämatoxylin/Hämatein heisst Hämalaun

Xylol
Xylol
Alkohol
Alkohol
Alkohol
Spühlen mit Wasser
Hämatoxylin
Spühlen mit Wasser
Differenzierung
Spühlen mit Wasser
Bläuung
Spühlen mit Wasser
Alkohol
Eosin
Alkohol
Alkohol
Xylol
Xylol

Gieson: eisen als Beizmittel
Progressive Färbung (schichten übereinander)

Zytoplasma, Muskulatur, Epithel – gelb
Schleim, Hyalin, Kolloid, Amyloid – rot,gelb