Tiergenetik

• Law of Dominance and Uniformity

Parents are homozygous (pure-bred) => All offspring in the F1 are equal in genotype and phenotype showing the dominant trait. 

• Law of Segregation

Two heterozygous parents for a certain trait => offspring differ in genotype and phenotype.

Dominant-recessive inheritance:

- Phenotypic ratio 3:1

- Genotypic ratio 1:2:1

Intermediate inheritance:

- Phenotypic ratio = Genotypic ratio 1:2:1

• Law of independent assortment

Dihybrid cross experiment with 2 separate traits => new phenotypes & trait combinations

Alleles for separate traits are passed independently => Mendel's assumption: Loci are on different chromosomes => Deviations from this principle due to genetic linkage

Ratio = 9:3:3:1 

• komplettes Gen entfernen
• Kozak Sequenz deletieren/ modifizieren
• (nur Promotor modifizieren kann noch schwache Expression hervorrufen)

• Homologe Rekombination/Gen-Targeting
• Zellvermittelte Transgenese (cell mediated transgenesis)

• Verschieben von vorteilhaften Gen/Allelen zwischen Rassen
• Verschieben von vorteilhaften Gen/Allelen zwischen Arten
• Verbesserung von Merkmalen, die für die genetische Selektion schwierig sind z. B. Krankheitsresistenz (Bsp. Porcine reproductive and respiratory disease virus (PRRSV)

Vorteile:

• Gene-Targeting möglich
• alle Zellen des Nachkommen enthalten das Transgen
• bei vielen Spezies möglich
• relativ hohe Effizienz (besser als Mirkoinjektion)

Nachteil:

• hoher technischer Aufwand
• stressiger Prozess für Embryo

• Genmodifikation mittels CRISPR-Cas, Meganukleasen, Zinkfingernukleasen
• Non-homologous end joining => Geneknockout (Insertion oder Deletionen) => Einzelbasenaustausch
• HDR (Homologous directed end joining) => Einzelbasenaustausch oder Geneinbringen mithilfe von Vorlage-DNA

In der Tierzucht ist man bestrebt, von besonders leistungsfähigen Kühen mehr Kälber zu erlangen. Hierfür wird beim Spendertier durch Hormonbehandlung eine gleichzeitige Reifung mehrerer Eizellen (meist 20–30) bewirkt. Sieben Tage nach der Befruchtung werden die Embryonen ausgespült und Trägertieren in die Gebärmutter eingesetzt. Auf −196 °C tiefgekühlt, können Embryonen von unterschiedlicher Qualität von jedem Landwirt für seine Zucht erworben werden.

Embryo transfer techniques allow top quality female livestock to have a greater influence on the genetic advancement of a herd or flock in much the same way that artificial insemination has allowed greater use of superior sires. ET also allows the continued use of animals such as competition mares to continue training and showing, while producing foals. The general epidemiological aspects of embryo transfer indicates that the transfer of embryos provides the opportunity to introduce genetic material into populations of livestock while greatly reducing the risk for transmission of infectious diseases. 

PRRSV (Porcine reproductive and respiratory disease virus):

• Es wurde gezeigt, dass CD163 ein zellulärer Rezeptor ist, der die Infektion von ansonsten nicht PRRSV-permissiven Zelllinien vermitteln kann
• CD163 ist ein Makrophagen-Differenzierungsantigen, das zur Familie der Scavenger-Rezeptor-Cystein-reichen (SRCR) Membranproteine gehört
• CD163 genome editing: Entfernung von Exon 7 à jeweils rechts und links von Exon eine sgRNA (single guide RNA) designen, damit Cas9 jeweils dort schneidet
• Ergebnis: geneditierte Schweine zeigen keine Anzeichen einer Infektion

HIV:

• Virus (HIV-1) tritt in T-Zellen durch Bindung an CD4 und CCR5 ein (beides Oberflächenproteine bzw. Rezeptoren)
• Vorgehen Bsp.: einbringen von CRISPR/Cas9 durch AVV Vektoren, zielt auf CCR5-Gen ab

wichtig für die Funktionalität:

• Tetraspanine 
• Lipid rafts, z.B. Cholesterol 

Zytokine = Botenstoffe, Einteilung: Interferone (IFN), Interleukine (IL), koloniestimulierende Faktoren, TNFs und Chemokine

Interleukine sind Zytokine, die zur Kommunikation der Immunabwehrzellen(Leukozyten) untereinander dienen, um so koordiniert Krankheitserreger oder auch Tumorzellen zu bekämpfen.

Diese Signalmoleküle werden von CD4-positiven T-Helferzellen, Monozyten, Makrophagen und Endothelzellen gebildet und wirken auf Zellen des blutbildenden Systems.

Resequenzierung für SNP – Identifikation. Dafür wird ein Refernzgenom beötigt, auf welches die Rohdaten aus der Resequenzierung gemappt werden.

Sequenzalignment bezeichnet den methodischen Vergleich zweier oder mehrerer Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen in linearer Abfolge. Es wird in der molekularen Phylogenie verwendet, um die funktionelle oder evolutionäre Verwandtschaft (Homologie) von Nukleotidsequenzen oder Aminosäuresequenzen zu untersuchen.

Durchschnittliche Genomabdeckung:

Ein Schwein hat wie jedes Säugetier eine Genomgröße von 3Gb. Die Genomabdeckung: 30Gb/3Gb = 10 => man hat also eine 10-fache Genomabdeckung.

• Synonymous: keine Veränderung, da die Mutation trotzdem noch für dasselbe Aminosäure kodiert.
• Non-synonymous: es entsteht eine andere Aminosäure 
• Conservative: es entsteht eine andere AS, aber vom selben Typ (z.B. basisch) 
• Non-conservative: es entsteht eine andere AS und sie ist von einem anderen Typ/Eigenschaften
• Regulatory Mutation: Mutation in einer Regulationseinheit, wodurch z.B. nicht transkribiert wird
• Splice-Mutation

=> Komplete oder teilweise Verlust der Funktion, wenn eine AS Austausch stattfindet und diese AS eine funktionelle oder strukturelle Bedeutung im Protein hatte. AS Austausch -> Stopcodon frühzeitige Abbruch der Translation -> verkürztes Protein

=> Genexpression verändert oder kein Transkription mehr

=> Falsches Splicing 

Mutation ist in TATA-Box, also Promotor ist mutiert => keine oder schwache Genexpression!

Das Prinzip behauptet, dass die genetische Variation innerhalb einer Population über die Generationen hinweg konstant bleiben würde, in der Abwesenheit von störende Faktoren, wie Selektion (manche Allelen können positiv/negativ auf das Überleben des Organismus wirken, Vorteil/Nachteil nicht mehr Zufall), Migration und Mutation (Einführung neue Allelen in der Population). Bei zufallige Fortpflanzung (mating) ohne die disruptive Bedingungen, wird behauptet (predict) dass sowohl der Genotyp als auch die Allel Frequenzen konstant bleiben würden, weil die im Gleichgewicht sind.

Autosomal – rezessiv: 

• beide Eltern zeigen keine Symptome. Die sind nur heterozygot Träger = rezessiv
• nicht über die Gonosomen (die beiden Geschlechtschromosomen (XY bzw. XX) des Menschen) vererbt, weil 1:1 verteilt -> autosomal (Gegenteil wäre gonosomal)

Finden mit GWAS = Genome-wide association studies: Case – Control (Fall – Kontrolle)

• Allele in Fall- und Kontrollgruppe für jeden SNP zählen, Kontingenztabelle erstellen
• Wenden Sie Chi-Quadrat-Test auf die Kontingenztabelle an
• Korrektes Signifikanzniveau nach Bonferroni
  • Nominal P (0,05) geteilt durch die Anzahl der SNPs
• Zeichnen Sie -log10 (P) für jedes SNP entlang der Chromosomen → Manhattan Plot

TATA Box:

• Nicht kodierende DNA-Sequenz
• Cis – Regulatorische Element
• Im Core Promotor Region ~ -31 bis -26 bp upstream von der Transkriptionsstart Stelle
• Bindung der Transkription Initiationsfaktor TFIID mit seiner TBP (TATA-box-Binding-Protein) Untereinheit. Enstehung eines Protein Complexes mit der RNA Poly 2 vor der Initiation der Transkription

=> Mutation in TATA-Box führt dazu, dass Transkriptionsproteine nicht binden und damit auch nicht die RNA-Polymerase => keine Expression

miRNAs:

• Ort: in Introns häufig als Cluster (Transkription units) => mehrere miRNAs werden hintereinander kodiert
• Funktion: binden an mRNAs zur Inhibition der Translation & Abbau von mRNA => eine mRNA wird von mehreren miRNAs kontrolliert & ein miRNA kann mehrere mRNAs kontrollieren!

Bildung von miRNAs:

• Transcription: Transkription der miRNA Gene durch RNA Polymerase II zu pri-miRNA => pri-miRNA hat eine typische Hairpinstruktur (Erkennungsstelle für prozessierende Proteine) und besitzt 3' Poly-A-Schwanz & 5' Cap
• Cropping: Drosha bindet an DGCR8 (wichtig für Erkennen der Sequenz) und bildet Mikroprozessorkomplex => erkennt pri-miRNA an Hairpinmotiv & Drosha erzeugt dabei  pre-miRNA durch ein Schnitt zwischen lower und upper stem (3' Überhang)
• Export: Anschließend wird die entstandene pre-miRNA über Expertin 5 und RAN-Proteinen aus dem Zellkern exportiert (Exportin 5 erkennt pre-miRNA durch sticky ends)
• Dicing: Dicer (RNAse 3) interagiert mit einem dsRNA-Bindeprotein TRBP, welche Dicer stabilisiert, und schneidet die Terminal Loop ab (sticky ends).
• Product release: Das entstehende Produkt wird miRNA-miRNA*-Duplex genannt (2 miRNAs - guide & passenger Strang* - liegen in einem Komplex vor) 
• Sorting: Ein Argonaut-Protein (AGO) bindet mit HSC70-HSP90 an miRNA-miRNA*-Duplex und entwindet den Duplex, verwirft dabei den miRNA* passenger Strang.
• Der entstehende miRNA AGO Komplex wird auch RNA-induced-silencing-Complex (miRISC) genannt
• Anschließend erzeug miRISC Komplex verschiedene Wirkungen. 

Andere Biogenesewege von miRNA: TUTase abhängig, DROSHA-DGCR8 unabhängig usw. 

Die Erkennung der mRNA erfolgt dabei über sogenannte Seed-Regionen. Das sind identische Abschnitte zwischen mRNA und miRNA, wodurch beide RNA zu einem Duplex hybridisieren können.

Dabei gibt es verschiedene Arten von Bindestellen (siehe Bild).

=> diese sind modifizierte Versionen einer miRNA

1. Polymorphic isomiRNAs = bedeutet einzelne Punktmutationen in micro RNA

2. Variation am 3‘ Ende = Seedsequenz nicht betroffen

3. Variation am 5‘ Ende = Seedsequenz betroffen

Unterschiedliche Situationen erfordern unterschiedliche Regulation. Der Organismus muss in einer Situation mRNA A, B und C silencen und in einer anderen mRNA B und C usw.

Darum hat jede Isoform der miRNA eine Core Network an mRNAs, die durch die miRNAs beeinflusst werden sollen und off-Targets, mRNAs die nicht beeinflusst werden sollen => durch Einsatz verschiedener Isoformen kann die off-Target Genregulation verhindert werden

1. Translationsstimulation durch Stabilisierung von PABP (Poly-A Binding Protein)

2. Translationsinhibition durch Ribosom Assemblierung Inhibition

3. Verfrühte Translations Termination über Bindung ans 3‘ Ende

4. Abbau Poly-A (Bindung an 3‘ UTR)

5. AGO 2 Splicing der miRNA

Extrazelluläre Vesikel (EV) sind durch Lipiddoppelmembranen abgegrenzte, nicht selbst- replizierbare Partikel. Es gibt Microvesikel, Apoptotic Bodies und Exosomen. Alle Typen sind von einer Lipid Doppelmembran umgeben und enthalten ein spezifisches Cargo.

EVs werden, als Drug Delivery Systems (DDS) genutzt, um Bioverfügbarkeit zu erhöhen und über eine organotrope Wirkungsweise Nebenwirkungen zu reduzieren.

1. Translokasen ändern Membranbeschaffenheit (vgl. Phosphatidylserin)

2. Actomyosin kontrahiert und begünstigt Budding => Vesikel-Bildung & Ablösung

3. ESCRT abhängiger Pfad => ESCRT-III sorgt für Vesikelabschnürrung

Exosomen bilden sich durch Bildung von Multivesicular Bodies, die mit der Plasmamembran fusionieren und dadurch die inneren Vesikel in den Extrazellularraum freisetzen. Der besondere Schritt ist, dass in das Early Endosome, Vesikel hineinknospen. Dies bezeichnet man auch als inward budding.

Tetraspanin-Mikrodomänen an der Membranaußenseite des Endosoms begünstigen inward-budding und cargo clustering im Multivesicular body. 

Es gibt viele funktionale wichtige Moleküle. Als Beispiel Anheftungsfaktoren zu nennen, wie Transmembranproteine (z.B Integrin) oder Rezeptoren, die bei dem Andocken der Exosomen an der Plasmamembran helfen. Exosomen enthalten darüber hinaus Hilfsmoleküle für intracellular trafficking (RAB-GTPasen, Annexin).

• miRNA
• mRNA
• Proteine

Exosomen besitzen spezifische Liganden auf der Membran, die an Rezeptoren der Zielzelle binden.

Exosomen werden als Drug Delivery Systems benutzt, um Bioverfügbarkeit zu erhöhen und Nebenwirkungen zu verringern.

EVs werden als objektive, schnelle, präzise und objektiv messbare Biomarker genutzt, weil Sie unteranderem miRNA enthalten, die krankheitsspezifisch in EVs zu finden sind.

Pathologisch: Induktion von Angiogenese bei Oncosomen

Biologisch: Interzelluläre Kommunikation

• Exosomen über Flüssigkeitsbiopsie isolierbar.
• Schützen miRNA vor Abbau und verbesserte Stabilität => dadurch bessere Sensitivität und Spezifität bei miRNA Biomarker Analyse

EV als Molekulare Biomarker für miRNA

• Definiertes molekulares Merkmal, das als Indikator gemessen wird, z. B. für eine Krankheit

• Steht in direktem Zusammenhang mit einer bestimmten Krankheit

• Präzise, reproduzierbare und schnelle Auswertung auf objektive Art und Weise

Vorteil von EV miRNAs

• Nicht-invasive Flüssigbiopsie

• Kurz = stabil

• Spezifische Information

• Frühe Bewertung zellulärer physiologischer Veränderungen

• Leicht zu quantifizieren bei sehr geringer zellulärer Abundanz

=> untersuchen mit NGS Illumina etc. (siehe andere VL), Quantifizierung, Aufreinigung (Purification), Größenauswahl, Qualitätskontrolle