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Flashcards
Kontamination
Unerwünschte Verunreinigung in der Zellkultur
Kontaminationsquellen
- Einbringen kontaminierter Zellen
- Laborgeräte, Glas- und Plastikwaren
- Medien, Reagenzien
- Luftkeime
Vorbeugung gegen Kontaminationen
- eingebrachte Zellen testen! Quarentäne
- Aseptisches Arbeiten
- Desinfektionsmittel
- Hygiene
- Regelmäßiger Test laufender Kulturen auf Kontamination
- Antibiotika nur im Bedarfsfall
- Sezieren getrennt vom ZKT Bereich
Sterilisationsverfahren
- Autoklavieren (121 ºC, 20 min, 12 bar). Kontrolle: Thermoindikator Bacillus stearothemophilus -> halten nicht die Autoklavierbedingungen aus. Lösung lila gefärb heißt, die Organismen haben nicht überlebt. Lösung gelb, Organismen haben Autoklaviervorgang überlebt
- Heißluftsterilisation: Verdunstungskälte (160 ºC, 180 min)
- Sterilfiltration: bei thermolabile Lösungen. 0,1 µm
- Druckfiltration: Bubblepoint, Druckhaltetest: Alternative Verfahren für Hitzelabile Lösungen
- Vakuumfiltration
- Keimfreiheit des Filtrats testen
typische Kontaminationen in der ZKT
- Bakterien
- Pilze
- Hefe
- Mycoplasmen
Effekte mikrobiologischer Kontamination
- MO konkuttieren mit Zellen um Nährstoffe im Kulturmedium
- Sekretion von sauren/ alkalischen Stoffwechselprodukten inhibiert Zellwachstum
- MO produziert H2O2 mit direkter Toxizität für die Zellen
- Verlust von Zelllinien/ chargen bzw Produkte der ZKT
- Exprimentelle Resultate fragwürdig
Applikation von Antibiotika
- Dauereinsatzt von Antibiotika -> Gefahr der Resistenzbildung, Hintergrundkontamination, Vernachlässigung der Grundregeln aseptisches Arbeiten
- Strategisch einsetzen (kurzfristig zB um kritische Experimente absichern)
- Nielmals unterdosieren
- Simultane/ konsekutive Kombination von Antibiotika ist problematisch
- Generell Antibiotikafreie Kultur vorziehen
- Regelung zur Herstellung von Therapeutika beachten
Mycoplasmen
Häufigste Kontaminationen
- Sieht man nicht im Lichtmikroskop
- 0,2 µm -> Wenn Verdacht auf Mycoplasmen dann 0,1 µm Filter benutzen
- Keine Zellwand
- Benutzen Arginin zur ATP Synthese -> Bei Mycoplasmenkontamination kommt es zu Argininmangel in der Zellkultur. Zellen sind Wachstumssuprimiert. Nach Zugabe von Arginin wachsen sie wieder.
- Multiple Effekte auf Zellfunktionen z.B. Metabolismus, Morphologie, chromosomale Aberrationen, etc
Nachweis von Mycoplasmen
- DAPI-Färbung (blaue Fluoreszenz, mikroskopieren)
- PCR (hohe Nachweisempfindlichkeit): Primer hybridisieren mit konservierte Regionen der 16S rRNA im Mycoplasmengenom. PCR vervielfältig Mycoplasmen DNA. Alle bekannten Mycoplasmenspezies von Säugerzellen werden somit detektiert.
Bekämpfung von Mycoplasmen
- Antibiotika: Minocyclin und Tiamulin (Proteinsynthese), Ciproflaxin (Gyrasehemmer)
- Nachbehandlung: Klonierung der Zelllinie und erneuter Test auf Mycoplasmen
- Co-Kultivierung mit Peritonealmakrophagen
Viren
Sieht man nicht, stören nicht wenn sie nicht Zellschädigend sind
- Hohe Wirtsspezifität/ -abhängigkeit
- Diagnose: Granularität, rascher Zelltod. Molekulare und immunologische Diagnostik begrenzt auf Humanpathogene
- Keine Dekontamination möglich
- Potentielle Gesundheitsgefährdung
Kreuzkontamination
Top kontaminationen: Mit Leberzellen (HeLa und HEK)
- Vermischung von Zellinien/ Differenzierungsstadien
- Kontrolle: Morphologie, Wachstumsrate, Produktoinseigenschaften
- Abhilfe: Klonierung identifizierter Zielzellen und erneuter Test auf Kontamination
Authentifizierung von Zelllinien
- Chromosomale Analyse
- Multilocus DNA fingerprint Analysis
- Short tandem repeats profiling (sicherste Methode)
Chemische Kontamination
Zellkulturen könnten reprimiert werden und Zellen könnten toxische Substanzen ausgesetzt werden
- Metallionen und andere Verunreinigungen in Kulturmedien, Wasser, etc
- Weichmacher in Schäuchen, Gefäßen
- Freie Radikale durch Photooxidation von Tryptophan, Riboflavin
- Rückstände von Desinfektionsmitteln, Detergenzien etc auf Instrumente
- Verunreinigung der Gases für den CO2 Inkubator
Effekt: Untypische Morphologie oder Zellantwort, Apoptose
Diagnose schwierig
Funktion von Zellkulturmedien
- Versorgung mit essentiellen Substanzen
- Neutralisierung von Abfallprodukten
- (Ersatz der Immunabwehr)
Harrison's Experiment
Embryonale Frosch- Neuralrohrfragmente in ein Tropfen Frosch Lymphe auf einem Deckglas. Dann Deckglas umgedreht (upside down) über eine Vertiefung in einem Objektträger (Hängende Tropfenkultur). Beobachtung der Entwicklung von Nervenfasern aus den neuronen im explantiertem Gewebe.
Lösung der grundlegende Probleme der ZKT: Medium, Kulturgefäß, Beobachtung, Kulturkontamination
Charakteristika von Zellkulturmedien
- Komponenten: AS, Vitamine, Kohlenstoff (z.B. Glucose), Serum bzw. Serumersatzstoffe, Spurenelemtente, anorganische Salze, Fettsäuren, Lipide, Puffersubstanz, pH-Indikator
- Geprüfte Qualität
- Gebrauchsfertige Lösung/Konzentrat, Pulvermischung
- Osmolarität, meist 260-340 mOsmos/kg H2O
- pH Wert, meist 7.2-7.4
- 6 monate Haltbarkeit bei -20 ºC
Serum
Bsp: Fetales Kälberserum
Bestandteile: Hormone, Wachstumsfaktoren, Vitamine, Anheftungsfaktoren, Aminosäuren, Anorganische Salze, Spurenelemente, Puffer, Neutralisierungskomponenten
Nachteile von Seren
- qualitative und quantitative Schwankungen
- Inhibitoren (z.B. Bakterientoxine)
- cytotoxischen Reaktionen mit Zellsekreten
- Proteasen
- in Experimenten störende Inhaltstoffe, z.B. Antikörper
- Quelle von Kontaminationen, z.B. TSE (Transmissible Spongiforme Enzephalopathie)
- unerwünschte Selektionseffekte
Selektionseffekt: Zellpopulation ist immer eine Mischung aus einzelner Zellen, die sich im Detail bisschen unterscheiden und je nach Serum Zusammensetzung kann es sein, dass nur ein bestimmter Teil dieses Subpopulation durch die Serum-Zusammensetzung gefördert wird oder aber auch Nachteile erleidet, d.h. nicht mehr so gut proliferiert wie der Durchschnitt der Population.
Serumfreie Medien
- Zugabe von Serumersatzstoffen
- Zusätze von Zellart abhängig
- Insulin (Glucose aufnahme), Transferrin (Eisentransport), Selenit (Antioxidant)
- Anheftungsfaktoren für adhärente Zellen
- Adaptationsphase: Sukzessiv Serumgehalt reduzieren, Zelldichte erhöhen
Weitere Mediumzusätze
- L-Glutamin: Wachstumsbegrenzend durch raschen Abbau
- Natriumhydrogencarbonat: essentieller Nahrungsbestadteil
- HEPES: Puffer ohne Begasung, für schnell wachsende Kulturen
Routinemethoden
1) Zellkulturen regelmäßig mikroskopieren
2) Austausch des Kulturmediums
3) Subkultur (passage)
4) Wachstumskurven
5) Zellzahlbestimmung
6) Transfetion
7) Kryokonservierung
Austausch des Kulturmediums
- Indikatoren: pH (Phenolrot = Physiologischem Bereich), Zellkonzentration, Zelltyp, Morphologische Veränderungen
- Intervalle sind Wachstumsabhängig (2-3 x Woche)
- Vor Mediumswechsel mikroskopieren
- adhärente Zellen: Medium dekantieren oder mit Pipette absaugen
- Suspensionskulturen: Medium aufstocken oder Zellen sedimentieren
Passagieren
Adhärente Zellen und Suspensionskultur
Passagieren = Zellen in neues Kulturgefäß übertragen
- Adhärente Zellen (Kontakte mit Wachstumsoberfläche): Subkultur vor Eintreten der Konfluenz = Belegung der gesamten Wachstumsfläche mit Monolayer.
Methoden:
- mechnanische Dissoziation: abklopfen, abspülen, abschaben (bei Zellen die keine Intensive Bindung mit dem Substrat machen)
- Proteolytische Enzyme: Trypsin.
Trypsinieren: Zellen waschen (PBS/EDTA ohne Ca2+, Mg2+), im Brutschrank mit trypsin Inkubieren -> Zellen abrunden (Kontakt mit Substrat/ Unterlage des Kulturgefäßes verlieren), dann inaktivierung von Trypsin mit Serum
- Suspensionskultur: Aliquot aus Zellkultur in neue Kulturflasche übertragen. Dabei muss man keine Zellen auflösen.
- Zytologische Änderungen durch Passagieren
- Minimale Einsaatdichte berücksichtigen
- Seneszenz wird durch häufige Subkultur/Passagieren beschleunigt (betrifft primär die diplodien Zellen -> Telomere verkürzen sich nach jeder Zellteilung)
Seneszenz:= irreversible Wachstumsstopp der Zellen
Zell-Zell und Zell-ECM Adhäsion
Transmembranproteine
- Cadherin (Zell-Zell): Gewebeentwicklung
- Integrin (Zell-ECM): ECM-Rezeptor, Zellwachstum, Überleben
- Ig Superfamilie: Embryonalentwicklung
- Selectin: Cell rolling
Wachstumskurven
Parameter
- Aussaatdichte
- Lag Phase: Kontakt zum Substrat bei adhärenten Zellen
- Log Phase: exponentielle Wachsumsphase
- Plateuphase: Dichtelimitierung/Kontaktinhibition. Davor sollte man die Zellen passagieren.
- Population Doubling Time: Zeitspanne, die eine Zellkultur braucht, um die Anzahl der Zellen zu verdoppeln. Unterschiedliche Zelllinien haben charakteristische exponentielle Wachstumsphasen.
- Saturation Density: Dichtelimitierung
Methoden zur Zellzahlbestimmung
- Vitalfärbung
- Farbstoff, geladen oder groß (MW > 200), z.B. Trypanblau -> kann intakte Zellenmembran nicht passieren, nur die defekten Zellen. Führt zur Färbung der abgestorbenen Zellen -> Anteil von vitalen und toten Zellen in der Zellkultur.
- Farbstoffe, die nach Metabolisierung fluoreszieren. Leuchtende Zellen sind vital.
- Hämocytometer
- Elektronische Zellzählung
- Messung der Widerstandsänderung (Jede Passage führt zu einer änderung der Spannung
- Signalauswertung über Pulsflächenanalyse
- Zellgrößenverteilung, Zellzahl
- CMOS Mikroskop
- Messung von adhärierten Zellen im Inkubator
- Zellen werden im Inkubator gezählt
- Zellzahl, Konfluenz, Wachstumskurven
- FACS (Fluorezcence Activated Cell Sorter)
- Einzelzellen passieren Lichtstrahl
- Lichtstreuung forward scatter (FSC, Zellgröße), side scatter (SSC, Granularität)
- Signalanalyse
- Elektrische Beladung (wird entschieden ob/ wie die Zelle geladen wird)
- Tropfenbildung
- Sortierung nach elektrischen Feld
Identifizierung von Zellpopulationen über zweifache Fluoreszenzmarkierung
FACS ist auch mit Fluoreszenzdetektoren ausgerüstet (FL1, FL2 => detektieren grün und rot fluoreszierende Zellen). Wenn man Subpopulationen weiter differenzieren wollen (z.B. unterschiedliche Oberflächenmarkern von Lymphozyten). Dafür kann man die Zellen vor FACS mit Antikörper (B- oder T-Zell spezifisch) vorinkubieren und diese Antikörper sind konjugiert mit einem grün oder rot floureszierenden Pluophor. Neben Größe und Granularität erhält man auch die Information über die beiden unterschiedlichen Oberflächenmarkern in Zellkulturpopulation.
Zelluläre Parameter:
- Volumen und morphologische Komplexität
- Zellpigmente
- DNA
- RNA
- Chromosomenanalyse und sortierung
- Proteinexpression und Lokalisierung
- Transgene Produkte in vivo
- Zelloberflächenantigene
- Enzymaktivität
- Apoptose
Transfektion
Einbringen von Fremd-DNA oder RNA in tierische und teilweise auch andere eukaryotische Zellen
- Transiente Transfektion: Plasmid wird in die Zelle eingebracht, Protein wird exprimiert (ectopische Expression) für ein kurzes Zeitraum. Irgendwann stoppen die Zellen dieses Protein zu exprimieren, da die Fremd-DNA abgebaut wird. Plamide haben kein Ori für Säugerzellen, also Vermehren sich nicht. Es findet eine Verdünnung statt. Man hat unterschiedliche Expressionsraten vom Gen der auf Plasmid kodiert wurde. --> Heterogene Zellpopulation
- Stabile Transfektion: Integration der transfizierte DNA stabil in das Zellgenom --> Homogene Zellpopulation. Das Plasmid mit dem Zielgen wird über Zellteilung weiter übertragen. In jede Zelle wird das Protein exprimiert and der selben Stelle im Genom. (Nur ein Bruchteil der Zellen machen die Integration ins Genom, man muss identifizieren welche Zellen wurden transfiziert und versucht diese zu isolieren und daraus eine Zellpopulation aufbauen)
Nachteil: Isolieren der Zellen und Aufbau neuer Zelllinien dauert sehr lange
Eukatyotisches Expressionsvektor
Promotor und poly A Schwanz sind notwendig
Transfektionsmethoden
- Carrier vermittelte Einführung der DNA
1) Positiv geladene Trägermoleküle werden mit der DNA vermischt und zu den Zellkulturmedien gegeben: Calciumphosphat, DEAE, Liposomen, Mizellen Membran
2) Carrier DNA Aggregate binden an Plasmamembran und werden aufgenommen
- DIrekte Einführung der DNA
- Nukleofektion: DNA wird direkt ins Zellkern transprotiert
- Elektroporation: Elektrisches Feld unterbricht vorübergehend die Plasmamembran
- Biolistik: Abfeuern von DNA beschichteten Partikeln in die Zelle
- Mikroinjektion
Typische Transfektionsprobleme
1. Geringe Transfektionseffizienz
2. Exzessiver Zelltod
- Übermäßige Exposition der Zellen mit den Transfektionskomplexen
- Verwendung von zu viel Transfektionskomplex
- Gestresste Zellen
- Ungünstige Vektorwirkungen
3. Variable Transfektioneffizienzen in wiederholten Experimente
- Inkonsistenz der Zellkonfluenz in Replikat-Experimente
- Mycoplasmakontamination
- Verwendung von Zellen mit hoher Passageanzahl
- Serumvariabilität
Cryokonservierung
1. Kultur unterbrechen
2. Konservierung von Zwischenstadien
3. Anlegen von Sicherheitskopien
- Master Stock: Kryokonservierte Zellen, die ausschließlich zum Auffüllen der Working Cell Bank bestimmt sind
- Working Stock: Kryokonservierte Zellen, die zur weiteren Bearbeitung bestimmt sind. Sicherheitskopien mit denen alle Leute im Labor arbeiten dürfen
4. Reduzierung der Seneszenz
- Lagerung im flüssigen Stickstoff
- Schutzsubstanzen: Glycerin, Dimethylsulfoxid (verhindern, dass beim einfrieren sich kristallwasser in den Zellen bilden, die dann dazu führen, dass die zellulären Membranen von den Organellen verletzt werden) und Serum. Schutzsubstanzen sind in der Lage Wasser zu binden.
- prinzip: Kontrollierte Temperaturabsenkung
- Auftauen: Wasserbad -> Verdünnen -> Waschen
Primärkultur
Kultur von Zellen, Geweben und Organen in vitro, direkt aus Organismus entnommen
- Kulturziel
- Näher an in vivo Verhältnisse als Permanentlinien
- Begrenzte Verfügbarkeit von Permanentlinien für spezifische Fragestellungen
Isolierung von Primärzellen aus Gewebeexplantate
- Auswachsen von Isolaten (selektion durch Migrationskomplex): Man nimmt ein kleines Gewebestück vom Organ und setzt es in eine Petrischale und überschichtet es mit Kulturmedium. Dann wachsen aus dem Isolat Zellen. Wenn diese die Zielzellen sind, die man isolieren will, werden die abgeschabt und in neues Kulturgefäß übertragen.
- Mechanische Dissoziation (selektion durch mechanische Stabilität): Gewebestück durch Skalpell zerschnitten, durch Sieb drücken. Diese Siebe haben kleine Pore, so dass nach und nach dieses Gewebe sich auflöst, mit Pipette aufziehen.
- Enzymatische Dissoziation (selektion durch Proteaseresistenz): Wenn die Proteasen (Trypsin, Collagenase, DNase) ein Isolat auflösen, dann bekommt man eine hochviskose Lösung (schleimartig, nicht wässrig), da bei der ganzen Isolierung von dem Gewebstück manche Zellen verletzt wurde und die DNA freigesetzt wurde. Diese DNA führt dazu, dass die Zellen trotz Auflösung der Verbindungen mittels Proteasen miteinander zusammenhängen. Deswegen wird es dabei DNAase zugegeben, um diese freigesetzte DNA noch aufzulösen. Dann bekommt man Einzelzellen.
Anlegen einer Primärkultur
- aseptische Präparation
- Fett & nekrotisches Gewebe entfernen
- Isolat fein zerteilen
- Dissoziation
- Entfernung von Proteasen und letale Zellen
- hohe Aussaatdichte
- Nährstoffreiches Medium
- fetales Gewebe
- täglich kontrollieren
Primärkultur Lymphozyten (Motile Zellen)
- Blut mit Heparin aufziehen (verhindert das Gerinnen/ Verklumpen des Blutes)
- Dextranlösung zugeben -> Bindet selektiv an verschiedene Formen von Blutzellen, sodass das Gewicht erhöht wird, insb rote Blutkörperchen
- Erythrocyten sedimentieren und Überstand abziehen
- Dichtegradientenzentrifugation -> Die unterschiedliche Blutzellen werden nach ihrer Dichte getrennt (Plasma, Monocyten, Lymphocyten, Thrombocyten, Trennmedium, Erythrocyten, Granulocyten)
- Schicht in der Mitte mit Monocyten, Lymphocyten und Thrombocyten wird isoliert
- Zellen waschen und zentrifugieren, Thrombocyten bleiben im Überstand
- Rückstand in Kulturmedium aufnehmen
Lymphocyten sind im Kultur nicht teilungsfreudig, deswegen gibt man in dieser Phase der Primärkultur unterschiedliche Mitogene zu (z.B. Phytohämagglutinin; wirk auf Lmyphozyten mitogen).
Immunmagnetseparation
Blutzellen werden mit Antikörper (gegen Oberflächenantigen gerichtet) und paramagnetische Partikel inkubiert, so dass sie zusammen Komplexe bilden. Diese Zellen werden dann über eine Säule gegeben und die Säule ist ein Magnetfeld ausgesetzt. Die Zellen, die über den Antikörper mit eine Magnetpartikel markiert sind, werden im Durchfluss zurückgehalten. Alle nicht markierten Zellen fließen durch. Dann nimmt man die Säule mit verbliebenden spezifisch markierten Zellen aus dem Magnetfeld weg und eluiert diese.
2 Konzepte:
- Positiv Selektion: Man markiert mit dem primär Antikörper die Zielzellen die man haben möchte, die dann über die Magneten zurückgehalten werden
- Negativ Selektion: Man markiert die nicht-Zielzellen (bevorzugt, Zielzellen werden nicht markiert)
Arten von Komplexe:
- Antikörper ist direkt mit Magnetpartikel verbunden
- Primär Antikörper erkennt das Epitop der Blutzelle und ein sekundär Manetgebundenen Antikörper ist gegen die konstante Regionen der primären Antikörpers gerichtet.
- Tetramere Verbindung von zwei Antikörper, eins bindet am Epitop, der andere bindet mit seinem Paratop an eine Magnetpartikell (Vorteil: Paratope der Antikörper werden hier nicht verändert => höhere Selektivität).
Je größer die Magnetpartikel, desto geringer muss der Magnetfeld sein.
Techniken der Zellseparation
- Immune panning: AK auf Oberfläche immobilisiert, gemischte Zellsuspension zugeben.
- Zentrifugale Elutriation: Zellen nach Dichte und Größe auftrennen.
- FACS
- Affinitätschromatografie: Säulen die mit AK beschichtet sind
Primärkultur von Nervenzellen (Homogenes Spendergewebe)
- Schädeldeckel öffnen
- Cerebellum freipräparieren
- Cerebellum zerkleinern
- Dissoziation in Trypsin und DNase
- mit Pasteurpipette in Einzelzellen zerlegen
- zentrifugieren und Rückstand im Medium aufnehmen
- Kulturschale in humidifizierte Petrischale
- 3 Wochen Kultur ohne Mediumwechsel
