Biochemische Analytik

Optische Spektroskopie: WW elektromagnetischer Strahlung mit Materie (Atome, Moleküle, Festkörper, Flüssigkeiten)

Typen der WW: 

• Transmission: Strahlung geht durch und Intensitaet verringert sich. 
• Absorption: Intensitaet verringert sich. 
• Streuung: Austretende Strahlung hat die gleiche Wellenlaenge wie vorher, aber kleinere Intensitaet und andere Streuwinkel (Strahlung wird abgelenkt). 
• Reflexion: Licht wird in gleicher Richtung zurückgeschickt. 
• Emmision: Austretende Welle hat eine andere Wellenlaenge (Verschiebung der Wellenlaenge), Intensitaet aendert sich und Strahlung wird gestreut/abgelenkt. 

• Welle-Teilchen-Dualismus
• Photonen, Geschwindigkeit = c
• Ruhemasse null 
• Elektrische Komponente (Feldvektor E) & Magnetische Komponente (Feldvektor H)
• E und H sind gegenseitig orthogonal und orthogonal zur Ausbreitungsrichtung des Lichts
• Polarisation (Ausrichtung von E & H), linear od. zirkulaer polarisiert => Alles Licht ist polarisiert!
• Wellenlaenge (Distanz), Frequenz (Zeit), Energie

Je kürzer die Wellenlaenge ist, umso höher ist die Frequenz und die Energie von der Strahlung. 

Jablonski-Diagramm → zur Darstellung von energetischen Übergaengen (Absorption & Emission)

Energieniveaus von Schwingungen: v 

Energieniveaus von Rotationen: l 

Bei RT sind fast alle Moleküle im elektronischen und vibronischem Grundzustand, wobei nur Rotationsniveaus signifikant besetzt sind. Im Grundzustand gibt es keine Schwingungen (v = 0). 

Im Fall einer geringer Energiezufuhr, z.B. durch Mikrowellen oder IR (thermische Energie) beginnen Moleküle starker zu rotieren und schliesslich zu schwingen. Bei staerkerer Energiezufuhr, z.B. UV-VIS-Strahlung werden Elektronen in angeregte Zustaende überführt → Absorption. Elektronenübergaenge vollziehen sich sehr schnell (instabil, keine Dissoziation - Dissaziationsgrenze: Bei Zufuhr hoher Energiemengen, können Elektronen aus Bindungen entfernt werden): 

• i.d.R unter Beibehaltung d. Spins - erlaubte Übergaenge - kurze Lebensdauer
• Elektronenübergaenge unter Spinumkehr sind verboten → angeregter Triplettzustand - lange Lebensdauer (Phosphorenz)

Elektronischer Übergang passiert sehr viel schneller als Kernschwindungsübergaenge → Molekül nimmt in S1 aehnlichen Schwingungszustand ein wie es in S0 hatte (Wellenfunktion).

Beim Franck-Condon-Prinzip geht es hauptsächlich darum, dass die Wellenfunktionen aus S0 und S1 überlappen müssen. Das heißt die Bewegung, die das Molekül in S0 gemacht hat, will es in S1 erst mal weitermachen. Man kann sich das vorstellen wie eine träge Feder, die schwingt und die Schwingung erst mal beibehält auch wenn sie in S1 übergeht. Nicht alle Schwingungszustände in S1 sind daher gleich gut für den Übergang und es wird der Schwingungszustand besetzt, der der ursprünglichen Bewegung am nächsten kommt.

Schwingungsrelaxation: Übergang von höheren Schwingungsquantenzahlen zu Schwingungsquantenzahl v = 0 (z.B. von V3 zu V0 bei S1)

• strahlungslos
• keine Emission von Photonen
• Waerme wird freigegeben, weil das Molekül sich bewegt (Energie wird in Form von Waerme übertragen)

Emission: Elektron faellt unter Emission eines Photons zurück in Grundzustand (Fluoreszenz, von angeregten Zustand zur Grundzustand)

Rotverschiebung: Wellenlaenge der absorbierten Strahlung ist meistenz kürzer (energiereicher) als die Wellenlaenge von Strahlung, die emittiert (energiearmer) wurde und der Grund dafür ist, dass durch Schwindungsrelaxation in S1 oder S0 Energie verloren wird. 

• Schwingungsrelaxation (Intersystem Crossing): Übergang von höheren Schwingungsquantenzahlen zu v = 0, keine Emission von Photonen, Waerme wird abgegeben. 
• Innere Umwandlung (Internal Conversion IC): Oft überlappen die angeregte elektronische Zustaende und Grundzustand. Dabei findet ein strahlungsloser Übergang zw. verschiedenen elektronischen Zustaenden.

Intersystem crossing ist strahlungslos und Spin dreht sich um. 

Fluoreszenz entsteht bei der Emission und hat eine sehr kleine Lebensdauer. 

Phosphoreszenz entsteht bei dem Rückkehr von Triplettzustand zum Grundzustand. Da zuerst die Spinumkehr stattfinden und danach Zurückfall in den Grundstand passieren soll, ist es zeitlich hinauszögert. Phosphoreszenz hat damit eine lange Lebensdauer. 

Transmission: Die Intensitaet, die aus der Probe durchkommt

Absorpton: Strahlung wird in der Probe absorbiert, Intensitaet wird geringer 

Lambert-Beer'sche Gesetz: \(A = log(I_{0}/I) = \epsilon \cdot c \cdot d\)

• Konzentrationen bestimmen
• Identität des Analyst bestimmen
• Detektion von Biomolekülen
• Reaktionskinetik verfolgen/messen
• Strukturaufklärung z.B. funktionelle Gruppen, alpha-Helix od. beta-Faltblatt bestimmen

• 760 nm - 1000 µm 
• Anregung von Schwingungsniveaus (diskrete Schwingungszustaende) & Rotationsniveaus bei FIR
• IR-Aktivitaet: nur die Schwingungen sind IR-aktiv, die das Dipolmoment aendern.
• Je mehr Atome im Molekül, desto komplexer ist IR-Spektrum
• Charakteristische Banden der funkt. Gruppen & Peptidgruppen, z.B. FAB-Fragment & Schwingungsarten
• IR-Spektroskopie von Zellen, z.B. Unterscheiden zw. Tumor- und Gewebezelle
• Absorptionsmessung wird in gleicher Richtung wie einstrahlendes Licht gemessen. 

Anwendung:

• Gleich wie Absorptionsspektroskopie
• Ist das Protein richtig gefaltet oder nicht? Wurde es rekombinant hergestellt? 

Schwingungsenergie wird nur dann aufgenommen, wenn sich das Dipolmoment aendert.

Schwingungsfreiheitsgrad: 3N-6, bei linearen Molekülen 3N-5

• Anregung elektronischer Übergaenge (aeußere oder delokalisierte Elektronen werden angeregt) => Elektronen werden in angeregte Zustaende überführt, z.B. von S0 in S1 (Frank-Condon Prinzip)
• Wellenlaengenbereich: 100-760 nm
• Bei Proteinen: Peptidbindung (halbaromatische Systeme, Übergaenge von bindenden in antibindende Orbitale) & Aromatische Seitenketten (aromatische Systeme mit delokalisierte Elektronen) & prosthetische Gruppen, z.B. Retinal bei Rhodopsin
• RNA/DNA bei 260 nm
• Detektion von Peptiden/Proteinen in chromatographischen Trennungen durch Einzelwellenlaengenmessung => Jedes Protein hat einen unt. Extinktionskoeffizient, abh. von der Anzahl der aromatischen Gruppen bekommt das Protein eine höhere Absorptionswert => relativer Vergleich des gleichen Proteins in versch. Proben ist erlaubt 
• Konzentrationsbestimmung von Peptiden/Proteinen, z.B. Kolorimetrie

Anwendung: 

• Bestimmung des Gehalts
• Strukturaufklaerung
• Identitaetsprüfung
• Reaktionskinetiken und -intermediate
• Detektion von Biomolekülen 

• Emissionsspektroskopie
• Frequenz der Fluoreszenz ist immer kleiner, also energieaermer (größere Wellenlaenge) als die vorangegangenen Absorption (Rotverschiebung, stokes shift wegen Schwingungsrelaxation, strahlungsloser Übergang)
• Schwingungsrelaxation zw. Schwingungsniveaus, Fluoreszenz/Phosphoreszenz bei Übergaenge zw. elektronische Zustaende (Fluoreszenz, z.B. bei Übergang von S1 zu S0, Phosphoreszenz, z.B. bei Übergang von T1 zu S0)
• Bei Emission sind die Schwingungsniveaus von S0 maßgeblich, da deren Wellenfunktion mit dem v = 0 von S1 überlappen soll. 
• Emissionsmessung ist senkrecht zu einstrahlendem Licht.

• Intrinsische Fluoreszenz

Fluoreszenz geht vom Molekül direkt aus, welche abhaengig von der molekularen Umgebung ist. Meistens Tryptophan bei Proteinen. 

• Fluoreszierende Biomoleküle

Naturstoffe, z.B. Bilirubin; Proteine, z.B. GFP

• Extrinsische Fluoreszenz

Fluoreszenz geht von eingebauten Chromophoren aus (Fluoreszenzsonden), die durch: 

- Interaktion (Wechselwirkungen) mit dem Chromophor

- chemische Reaktion mit dem Chromophor

- genetisches Einbringen, z.B. Fusionprotein mit einem GFP-Tag 

- immunchemische Reaktion, z.B. Antikörper, welche Protein bindet und ein GFP beinhaltet

Fluoreszenz zeigen, z.B. DAPI.

Die Polarisation einer Transversalwelle beschreibt die Richtung ihrer Schwingung. Ändert sich diese Richtung schnell und ungeordnet, spricht man von einer unpolarisierten Welle.

Sonnenlicht (polarisiertes Licht) enthält alle möglichen Richtungen von dem Feldvektor. Wenn es auf Material trifft, dann werden da Elektronen angeregt => danach findet Relaxation (Reflexion, Streuung, Emission) statt => senden Lichtwellen aus, die orthogonal zur Schwingungsrichtung der Elektronen (Ausbreitungsrichtung) stehen => bestimmte Polarisation des Lichtes. 

• Polarisationsfilter

Nur der Anteil des Lichtes der senkrecht zum Filter steht, wird durchgelassen. 

• Optisch aktive Substanzen

Sie wirken aehnlich wie die Polarisationsfilter. Sie absorbieren Licht abhaengig von der Lichtpolarisation und ihrer atomaren/molekularen Umgebung. 

CD untersucht die unterschiedliche Absorption durch optisch aktive Substanzen (chirale Zentren). 

Optisch aktive Substanzen absorbieren das links und rechts zirkulaer polarisiertes Licht unterschiedlich stark. Deswegen bildet sich bei denen ein elliptisch polarisiertes Licht, wenn beide summiert wird. 

CD-Spektroskopie misst die Elliptizitaet in Abhaengigkeit von der Wellenlaenge. Absorption wird maximal (minimal) bei paralleler (senkrechter) Anordnung von einfallender Welle und absorbierendem Chromophor (aehnlich wie bei Polarisationsfilter). 

Elliptizitaet = \(\Theta(\lambda) = const (\epsilon_{L} - \epsilon_{R}) \cdot c \cdot d\)

• Kurz vor Absorptionsmaximum schlaegt Elliptizitaet aus. 
• Beim Absorptionsmaximum ist die Elliptizitaet null. 
• Nach Absorptionsmaximum weiterer Ausschlag. 

Zwei Enantiomere eines Moleküls zeigen einen gleich großen Cotton-Effekt aber mit verschiedenem Vorzeichen.