V404A

• Genvorhersage startet mit der Identifizierung von offenen Leserahmen (Computer)
• Die Annotation weist Genen Funktionen zu
  • Proteine mit gleicher Funktion sind häufig evolutionär verwandt (homolog)
• Um Annotation nachzuweisen wird die Genetik verwendet: z.B. Knockout-Mutanten, Expression eines Proteins, Aufreinigung etc.

Organismus-spezifisch werden einige Codons häufiger verwendet als andere

• Kleineres Genom: stabile Habitate, metabolisch einseitig -> z.B. das Meer
  • Weiteres stabiles Habitat: Wirt-Parasit-Beziehung
• Großes Genom: variable Habitate, metabolisch vielseitig (viele C-Quellen), komplexe Lebenszyklen -> z.B. der Boden

• Enthalten reduzierte bakterielle Genome
• Enthalten Proteinbiosynthese-Maschinerie
• Endosymbiose
• Plastidengenom: noch ca. 100 – 200 Proteine
• Mitochondriales Genom: 13 Proteine
• Endosymbiontischer Gentransfer
  • Im Laufe der Zeit haben die Mitochondrien und Plastide Gene verloren
  • Zusätzlich sind bakterielle Gene in den Zellkern eingebaut worden
• Proteinimport: Protein wird wieder in das Organell gebracht

• Große Vielfalt von Größen: intergenomische Sequenzen
• C-value paradox: Die Komplexität eines Organismus (Hefe < Nematoden < Fliege < Mensch) korreliert nicht mit der Genomgröße
• G-value paradox: Die Komplexität eines Organismus spiegelt sich nicht in der Anzahl der kernkodierten Gene wider

Bezieht sich auf die Analyse von Genommischungen

• Bakterien in einer Community können sich anders verhalten als in Reinkultur

• Erster Ansatz: Community
  • Markergen: 16S rRNA 
  • Erstellung von Phylogenie-Stammbäume
• Zweiter Ansatz: Umwelt
  • Rekonstruktion ganzer Genome -> kurze überlappende Fragmente, die später wieder zusammengesetzt werden
  • Entstehung von partiellen Genomen

• Bsp.: Community, die auf Cyanit wachsen kann
  • Cyanit = Atmungskettenhemmer
• Anfüttern mit einem Substrat, wo der Kohlenstoff markiert wurde (¹³C schwerer als ¹²C)
  • Nur der Organismus, der das Substrat verwerten kann, baut diesen Kohlenstoff ein
• Auftrennung mittels Caesium-Chlorid-Gradienten und Ultrazentrifugation
• Extraktion und Analyse

• DNA-Segment im Genom eines jeden Organismus
• Besitzt ORF und Regulatorische Sequenzen (Promotor, Terminator)
• Gene können vielfach benutzt werden

Veränderung der Struktur der Gene eines lebenden Organismus, um es gesünder, stärker oder nützlicher für den Menschen zu machen

• Möglich mit dem lac-System
  • pET-Plasmid: Gen, RBS und T7-Promotor = regulatorische Sequenzen
  • T7-Polymerasse, die von dem Stamm produziert wird, bindet an die RBS vom Plasmid
  • IPTG-Induktion kontrolliert die T7 RNA-Polymerase

• Prokaryoten
  • Ein ORF für das Gen wird benötigt
  • Gene in Clustern -> man erhält polycistronische mRNA
• Eukaryoten
  • Primäre Transkripte mit Exons und Introns
  • Durch Spleißen müssen erst die Introns entfernt werden, um die gewünschte mRNA zu erhalten

• Startmaterial: gDNA
• In vivo Klonierung: Amplifikation in Bakterien -> Restriktionsenzyme, ungezielt
• PCR in vitro: Amplifikation in vitro -> gezielt

• Gen der gDNA amplifizieren
• Problem: Introns in eukaryotischen Genen
  • Bakterien können mit Introns nicht umgehen -> Genexpression gestört

• mit RNA starten 
• Eukaryotisches Gen, dass für Bakterien zugänglich gemacht wird
• mRNA wird in cDNA umgewandelt -> reverse Transkriptase
• Komponenten für cDNA
  • polyA RNA
  • polyT Primer
  • Reverse Transkriptase

• EcoRI = sticky ends
• EcoRV = blunt ends -> DNA-Fragmente können sich beliebig ausrichte

• Prokaryotischer Wirt
  • Promotoren und Operatoren -> Expression des Gens unter bestimmten Nährstoffbedingungen
  • Ribosombindestelle
  • Aktivierende und reprimierende Stellen
• Eukaryotischer Wirt
  • Promotor
  • Introns können beibehalten werden -> Splicing
  • Export der mRNA vom Nukleus
    • Translation im Cytosol
  • Eukaryotische, translationale Kontrolle

• Fusion von zwei Genen, verknüpft mit einer Proteaseschnittstelle
• Fusion mit einem Protein (Carrier), dass für die Aufreinigung genutzt wird -> Bsp. malE
• Spaltung mittels Protease gibt das Ziel frei
• Carrier-Proteine formen keine Einschlüsse von Proteinen (inclusions)
• Signal-Sequenz kann für die Sekretion hinzugefügt werden
  • Beim Export entfernt

• Genfusion an einen HIS-tag

• LacZ von E. coli kodiert ß-Galaktosidase
• Fluoreszente Proteine für Expressionsstudien von Promotorfunktionen
• Luciferase, um die die bakterielle Kolonisierung zu quantifizieren

• Wachstumsform bei Pilzen
• Einzellige, vegetative Wachstumsform, keine Sporen
• Vermehrung durch Sprossung oder Spaltung
• Vorwiegend bei Asco- oder Basidomyceten

• in Assoziation mit Pflanzen (Blätter, Blüten und Früchte = Zuckerquelle)
• im Boden
• in Salzwasser
• im Darm von Warmblütern

• beim Brot backen
• in Bier
• in Bioethanol

• vergärt Zucker zu CO₂ und Ethanol unter anaeroben Bedingungen
• Saccharomyces = der Saccharose-Spalter
• Toleriert ein breites Spektrum verschiedener Umweltbedingungen
  • Wachstum bei 12 – 40 °C und pH von 2.8 – 8.0
  • Verträgt bis 20 % Ethanol und 3 M Zucker
  • Überlebt Trocknung und Temperatur von 0 bis 55 °C

Hefezellen sind miteinander fusioniert und bestimmte molekulare Prozesse laufen ab

• positive Rückkopplung
• a-Zelle produziert a-Pheromon
• a-Pheromon-Rezeptor der α-Zelle erkennt das -> Signaltransduktion entsteht
• Gene für die Paarung werden transkribiert
• Auch wird mehr α-Pheromon produziert -> wird von der a-Zelle erkannt
• Zellen wachsen aufeinander zu, wo das meiste Pheromon herkommt

• Signalerkennung: Rezeptor und Heterotrimeres G-Protein
• Signaltransduktion: Rho-Protein, Kinase-Kaskade
• Shmooing: Formin 
• Zellzyklus-Stop: Kinase phosphoryliert den Zellzyklus-Inhbitor, Zellzyklus-Inhibitor reguliert die Cyclin-abhängige (G1-Cyclin) Proteinkinase
• Zell-Zell-Kontakt, Zellfusion, Kernfusion: Transkriptionsfaktor wird phosphoryliert: wandert in den Kern und aktiviert Genexpression

• Mutter kann Paarungstyp wechseln: α wird zu a, oder anders herum
• Stille Kopien vom α- und vom a-Typ
• HO-Endonuklease führt einen Dopplstrang-Bruch an dem Transkriptionsfaktor durch

• Transkriptionsfaktor Ash1p reprimiert HO-Expression in Tochterzellen: Repression der Tochter = Wechsel nur in der Mutter
• RNA-Transportmechanismus entlang des Aktin-Zytoskeletts zur Tochter
  • Akkumuliert am Pol der Tochterzelle und wird translatiert
  • Ash1p sieht den Tochterzellkern als ersten Zellkern
• Mutante: bei beiden Zellen wird der Paarungswechsel unterdrückt

• Wildtyp
• Funktionelle HO-Endonuklease
• Häufiger Paarungstypwechsel
• Fast nur diploide Zellen (MATa/MATα)

• Keine HO-Endonuklease (Gen inaktiviert)
• Kein Paarungstypwechsel
• Stabile haploide Stämme, entweder MATa oder MATα-Paarungstyp

• Heutiges Genom entstand durch eine Genomverdopplung
• Viele nahe verwandte Gene (ca. 450), oft unterschiedlich reguliert
• Bei ca. 1/3 der Gene ist eine Funktion bekannt
• Bei ca. 1/3 der Gene wird eine Funktion vermutet
• Bei ca. 1/3 der Gene ist keine Funktion bekannt
• Gene liegen eng beieinander: Abstände zwischen 200 und 1000 bp

• Mutagenese durch: chemische Agenzien (z.B. EMS -> GC wird zu AT), UV, Transposons
• Ziel
  • Jede Mutante ist nur an einem Genort verändert worden
  • Jeder Genort ist mindestens einmal verändert worden

• Funktioniert nur, wenn die Mutation rezessiv ist
• Kreuzung von isolierten Mutanten: MATa trp x (haploid) mit MATα trp y (haploid)
• Wachstumstest von MATa/MATα, trp x/trp y (diploid) auf Medium ohne Trp
  • Falls Wachstum möglich: TRPX ≠ TRPY (unterschiedliche Komplementationsgruppe)
    • Keine Komplementation möglich
  • Falls kein Wachstum: TRPX = TRPY (gleiche Komplementationsgruppe = Gen)

• Weit weg vom Centromer = mehr Crossover möglich
  • Je mehr Zellen z.B. rot werden (bei ade2), desto weiter ist der Marker vom Centromer entfernt
  • Bei zwei Markern (z.B. ura3 und ade2): je häufiger Uracil auftritt, desto weiter ist es vom Centromer entfernt

• Schnelles Wachstum: Verdopplung in 90 min möglich
• Mikroorganismus: Anzucht auf einfachen und (relativ billigen) Wachstumsmedien (Nährböden und Flüssigkultur)
• Mutanten sind einfach isolierbar (ungerichtete = EMS- oder UV Mutagenese und gerichtete = Deletion Mutagenese)
• Stabile haploide und diploide Stämme: klassische Kreuzungsexperimente
• Effiziente homologe Rekombination: Gendeletion und -insertion, Genaustausch (praktische jedes Basenpaar gezielt austauschbar)
• Vielzahl an Plasmiden verfügbar, konditionelle Genexpression, Überexpression, Genfusionen (Epitope, GFP), 2-Hybrid
• Umfangreiche Bioinformatik und Datenbanken

• Kontrolle der Enzymaktivität
• Translationskontrolle: KEINE Synthese des Enzyms
• Transkriptionskontrolle: KEINE Synthese der mRNA

• Kernenzym: 5 UE, Mg2+ Cofaktor
• Holoenzym: Kernenzym plus Initiationsfaktor (Sigma-Faktor), vermittelt Promotorspezifität (genaue Bindung am Promotor)
• UP-Element: potentielle Bindestelle für stärkere Interaktion (upstream element)

• 2 palindromische Sequenzen in der DNA 
• Transkript kann zu einer Haarnadelschleife gefaltet werden -> GC-reich, PolyU-Bereich (schwache Bindung)
• Destabilisierende DNA-Elemente in der 3’UTR der mRNA vermitteln Termination