Proteine: Struktur, Funktion und Engineering

(a) Histidin, Asparaginsäure und Serin. Man bezeichnet dies auch als katalytische Triade.

(b) Subtilisin gehört zu den Proteasen, genauer gesagt zu den Serinproteasen. Mechanistisch verwandt ist das Trypsin , welches eine Nahezu identische Anordnug bei unterschiedlicher Faltung besitzt.

(c) Subtilisin wird zunächst als Prosubtilisin exprimiert und zeigt in dieser Form nur eine sehr geringe Aktivität. Diese reicht jedoch aus sodass in seltenen Fällen andere Prosubtilisine zu Subtilisin zu gespaltenwerden , diese sind dann sehr aktiv und aktivieren wiederum die anderen Subtilisine. Mutiert man nun jedoch potentiell essentielle AS so kann es dazu kommen das selbst die geringe Aktivität des Prosubtilisins ausgeschaltet wird. Daher muss zusätzlich zum mutierten Subtilisin auch ein Wildtyp Subtilisin exprimiert werden, welches die Aktivierung der mutierten Prosubtilisine in Gang bringt.

Bei der Reinigung muss jedoch nun das mutierte Subtilisin vom Wildtyp Subtilisin abgetrennt werden. Dafür kann ein eine weitere Mutation erzeugt werden, bei der ein oberflächen exponierter Rest zu einem Cystein Rest mutiert wird. Anschließend können nun mit Hilfe von kovalenter Chromatographie die beiden Subtilisinarten getrennt werden.

(d) siehe Bild

(e) Die Reste der Trieade agieren stark synergetisch und beschleunigen nur zusammen die Substrat-Hydrolyse.

(f) His-Seitenkette an P2 des Substrats kann die Imidazol Gruppe der katalytischen Triade sterisch beinahe perfekt ersetzen.

(a) Parameter:

• Kavität
• reversible thermische Denaturierung
• Differenz der freien Transferenergie? 

(b) Die Kaviät lässt sich durch Volumen und Oberfläche korrelieren. 

(c) siehe Bild.

(d) Verkleinert man die Kavität, ohne dabei die freien Transferenergien der Aminosäuren (-Substituenten) negativ zu beeinflussen oder ungünstige sterische WW auszulösen, dann sollte dies die Proteinstabilität verbessern.

(e) Hydrophobie: aus "freien Transferenergien" mit ∆G = -RTlnk des Verteilungskoeffizienten: 

z.B. Wasser => Octanol (für N- und C-abgesättigte AS-Derivate)

\(K = \frac{[Xaa]_{Octanol}}{[Xaa]_{Wasser}}\)

=> stark von den Bedingungen abhängig, auch "Hydrophathie"

21. Aminosäure

• L-Selenocystein ist ein reaktives Analogon des natürlichen Cysteins, enthält statt des Schwefelatoms ein Selenatom.

22. Aminosäure

• Pyrrolysin ist ein Derivat des Lysins welches bei verschiedenen Bakterien Bestandteil von Enzymen des Metha-Stoffwechsels ist.

Chevron Plot

• Abhängikeit der Geschwindigkeitskonstanten der Faltung bzw. Entfaltung eines Proteins abhängig von der Denaturierungsmittelkonzentration.

Framework Model

• hypothetische Faltungsmechanismus mit Intermediat
• Bildung lokaler Elemente von nativer Sekundärstruktur
• darus Entstehung der nativen Tertiärstruktur durch Diffusion/Collision

Freie Transferenergie

• Energieunterschied des Wechsels von einem Medium in das anderen z.B. von purem Wasser in dei Lösung des Ko-Solvens in Wasser des Proteins

Faltungshysterese

• Kriterium für die thermodynamische Reversibilität beim Vergleich von Ent- und Rückfaltung

Substrate-assisted Catalysis

• Funktionelle Gruppe eines Substrats trägt zur Katalyse durch ein Enzym bei.

(a) Positiv:

• Erhöhung der thermischen Stabilität durch kovalente Quervernetzung innerhalb der Polypeptidkette bei der oxidierten Form der Mutante
• Kontrolle der Enzymaktivität über das Redoxpotential, wenn eine Disulfidbrücke eingefügt wird die das aktive Zentrum überbrückt und somit den Zugang für das Substrat sterisch hindert

Negativ:

• Die reduzierte Form der Mutante ist wenige stabil als de WT, da die Einführung der Cys Reste andere wichtige Wechselwirkungen unterbricht
• sterische Hinderung des aktiven Zentrums
• Fixierung flexibler Regionen in der Tertiärstruktur (Schleifenumfang)

(b) Entropische Destabilisierung des entfalteten Zustands (siehe Bild)

(c) Es gibt Kavitäten, die mit größeren Resten gefüllt werden können, doe Packungsdichte eines Proteins wird damit erhöht, was stabilisierend wirkt.

Durch den Austausch hydrophober Seitenketten können neue Kavitäten geschaffen werden oder bestehende vergrößert werden, was destabilisierend wirkt.

(d) Durch die Aufnahme von Benzol als einfaches Seitenkettenanalogon für Phe in den Hohlraum und Bindung führt zur Verkleinerung der Kavität => Hydrophobe Kavitäten lassen sich zur Aufnahme von Liganden durch Protein-Engineering quasi maßschneidern. 

(e) Vereinfachte Analyse des Wegfalls eines großen Teils der Seitenkette: Alann besitzt nur funktionell weitgehend neutrale Methylgruppen; wird eine funktionelle AS gegen Ala ausgetauscht, hat dies i.d.R. einen Verlust der Proteinfunktion zur Folge. 

(f) 

Vorteile:

• hohe Flexibilität der linearen Seitenkette (→ Anpassungsmöglichkeit an sterische Randbedingungen)
• ähnlicher Raumbedarf wie Leucin, Isoleucin, Phe

Nachteile:

• geringere Transferenergie
• Seitenkettenflexibilität liefert einen entropisch ungünstigen Beitrag zur Proteinfaltung und könnte zur Bildung einer „Molten Globule“-Struktur führen
• instabiler als AS mit verzweigter Seitenkette, relativ reaktiv 

Alanin ist eine durchschnittliche AS.

Isoleucin und Valin sind ß-verzweigte AS; spielen eine Rolle bei der Ausbildung der Sekundärstruktur, sind ß-Faltblatt-Bildner, sind ungünstig für α-Helix, da nur eine Seitenkettenkonformation erlaubt ist.

α-Helix:

Die α-Helix ist eine rechtshändig gedrehte Spirale (bevorzugt von L-Aminosäuren) mit durchschnittlich 3,6 Aminosäureseitenketten pro Umdrehung. Pro Windung wird eine Länge von p = 0,54 nm (5,4 Å) erzielt. Dieser Fortschritt wird als Ganghöhe bezeichnet. Dieser Abstand zwischen den Resten ist der Grund dafür, dass Aminosäuren, die in der Primärstruktur drei oder vier Stellen voneinander entfernt sind, sich in der Helixstruktur in unmittelbarer Nähe befinden. Stabilisiert wird die α-Helix durch eine Wasserstoffbrückenbindung zwischen dem Carbonylsauerstoff der n-ten und dem Amidproton der (n+4)-ten Aminosäure desselben Moleküls. 

• H-Brücke zwischen C=O von ASi mit N–H von ASi+4 (linear, parallel zur Helixachse) ⇒ "Nahordnung"
• 5,4 Å pro Windung
• Ala hat stärkste Tendenz zur Bildung der α-Helix
• Pro führt zur Störung der Geometrie, "Helixbrecher"
• "N/C-Cap": Asn und Gln sättigen über ihre Seitenketten die offenen H-Brückendonoren und akzeptoren

ß-Faltblatt:

• Basiseinheit: "β-Strang" (gestreckte Konformation)
• Anordnung der einzelnen β-Stränge parallel oder antiparallel (stabiler) mit H-Brücken-Netzwerk dazwischen
• natürliche β-Faltblätter sind verdrillt
• in der Primärstruktur entfernte AS werden räumlich zusammengebracht (Fernordnung) — Rolle der "Turns"

Nah- bzw. Fernordnung:

Reste, die die α-Helix ausbilden sind auch in der Aminosäuresequenz nach beieinander; Reste, die β-Faltblätter ausbilden können hingegen in der Primärstruktur sehr weit auseinander liegen.

• Serum-Albumin nur in alpha-Helix-Form.
• Immunoglobulin, ß-Keratin und CD8 nur in ß-Faltblatt-Form. 

Parallele Ausrichtung der Peptidgruppen => Makro-Dipolmoment: entsprechend 0,5-0,7 Elementarladungen an den Enden (N-Terminus positiv).

\(3_{10}\)-Helix, \(\pi\)-Helix, Collagen-Tripelhelix

(a)/(b)

\(\phi\): Torsionswinkel zw. C\(\alpha\) und N

\(\psi\): Torsionswinkel zw. C\(\alpha\) und C

Beide Diederwinkel sind variabel und erlauben unt. Konformationen. 

Bei gestreckter Konformation der Polypeptidkette gilt; 

\(\phi = \psi = 180\)

Darstellung im Ramachandran-Plot: 

X-Achse: Winkel \(\phi\) (von -180 bis +180)

Y-Achse: Winkel \(\psi\) (von  ´´   ´´ )

(c) Die Hauptregionen sind die erlaubten Konformationen einer Polypeptidkette. 

Kriterium: keine sterische Überlappung der Atome (2 Atome können zur gleichen Zeit nicht den gleichen Raum einnehmen => "excluded volume effect") 

(d)/(e) Glycin und Prolin haben keinen χ1-Winkel. 

Glycin: wegen der fehlenden Chiralität durch das Wasserstoffatom als Seitenkette. Das Glycin hat durch die daurch entstehende Symmetrie doppelt so viele Möglichkeiten an Drehwinkelkombinationen im Ramachandran Plot.

Für Prolin gilt dies ebenfalls nicht aufgrund der zyklischen Anordnung des Imidazolrings. Der Phi Winkel ist dabei der Winkel zum Stickstoff, welcher dadurch kaum variieren kann. Nur der Psi Winkel kann variieren.

(f) Prolin kann im Vergleich zu allen anderen Aminosäuren vergleichsweise häufig in der cis Konformation (20%) vorkommen hat also einen geometrischen Freiheitsgrad von 2 während alle anderen AS einen Freiheitsgrad von 1 besitzen also nur in der trans Konformation vorkommen. Dies liegt an der Sterik des Imidazolrings, während es bei allen anderen AS sterisch ungünstig ist ist, wenn die C-alpha Atome in der cis-Stellung auf der gleichen Seite liegen, wird bei Prolin dieser Effekt durch die Einbindung des C-alpha in den Imidazolring abgeschwächt.

Beschriftung der Achsen;

X-Achse: Denaturant/Temperatur? 

Y-Achse: Protein unfolded (in Prozentangaben)/ f(U)

Sigmoidaler Kurvenverlauf deutet auf Kooperativität hin.

Parameter:

• Kooperativitätsparameter m
• Gleichung der Observablen

Harnstoff und Guanidiumchlorid.

Guanidiniumchlorid hat die stärkere Wirkung (6M reichen aus, bei Harnstoff werden 8M benötigt)

Harnstoff kann sich chemisch zu Cyanat und Ammonium zersetzen.

(a) Lysin (Lys), Arginin (Arg), Histidin (His)

(b) Aspartat (Asp), Glutamat (Glu), Cystein (Cys), Tyrosin (Tyr), Histidin (His)

(c) Histidin (His), Phenylalanin (Phe), Tyrosin (Tyr), Tryptophan (Trp)

Für das Gedankenexperiment treffen wir eine Reihe von Annahmen die die optimale und damit maximale Entstehung von Proteinen ermöglichen. Wir gehen davon aus das Leben vor 4*10^9 Jahren auf der Erde begonnen hat. Weiterhin gehen wir von 1,2*10^18 m^3 Volumen an Ozean auf der damaligen Erde aus. Dies entspricht in etwa der heutigen Ozeangröße wobei von einer durchschnittlichen Tiefe von 4km ausgegangen wird. Nun nehmen wir an das sich in diesem Ozean eine dichte kultur (Zellpaste) von E.coli befindet welche mit dem Bakteriophagen M13 infiziert werden. Diese Phagen besitzen eine maximale Replikationsrate von 3 Generationen pro Stunde, dabei gehen wir von einer unntatürliche hohen Mutationsfrequenz  aus, bei der jeder Phage für ein neues Protein kodiert. Unter diesen Annahmen erhält man dann 10^55 Proteine als oberen Wert unter optimalen Bedingungen.

Für ein kleines globuläres Protein von 100 AS gibt es jedoch für jeder der 100 Stellen 20 Möglichkeiten also insgesamt 20^100 also ungefähr 10^130 Möglichkeiten. D.h es wurden 10^130 - 10^55 = 10^130 Proteine niemals in der Natur synthetisiert. Es hätte maximal ein Sequenzabschnitt von 55:1,3  also ca. 42 AS optimiert werden können.

Mit ca. 2000

Primärstruktur

Eine kovalente Struktue, welche sich rein aus der Aminosäuresequenz. Hinzu kommen potentiell postranslationale Modifikationen (unter anderem auch Glykolisierung) und Disulfidbrücken. Einige Proteine enthalten zusätzlich zu den Aminsäuren noch eine chemische Komponente. Diese bezeichnet man als konjugierte Proteine. Der Teil des Proteins der nicht aus Aminosäuren besteht wird als prosthetische Gruppe bezeichnet.

Sekundärstruktur

Lokale Konformation des Rückgrats v.a. alpha Helix, beta Faltblatt und Turns

Tertiärstruktur

vollständige Raumstruktur eines Polypeptids. Ein Beispiel hierfür ist eine Domäne, also eine klar umrissene stabil gefaltete Struktureinheit., z.B Zinkfinger Domäne ist der der aktive Teil in den Zinkfingerproteasen der die DNA bindet.

Quartärstruktur

Räumliche Anordnungen von Untereinheiten bei oligomeren Proteinen, z.B Hämoglobin, besteht aus 4UE. Allosterie ist die räumliche Änderung der Konformation der Struktur eines Moleküls unter dem Einfluss sich anlagernder niedermolekularer Verbindungen. Unter anderem wird auch der Wechsel des Hämoglobins von T zur R Form als Allosterie bezeichnet, damit gehört dieser Begrifff zur Quartärstruktur.

Polypeptid: längere Kette, definierteSequenz, keine Faltung

Protein: gefaltetes Polypeptid mit definierter 3D Struktur und biochemische Funktion

Stereochemische Besonderheit bei einer der Aminosäuren sowie eigentlich korrekte Substanzklasse einer anderen:

• Glycin ist nicht chiral, Isoleucin hat ein zweites Chiralitätszentrum 
• Prolin: Iminosäure (Pyrrolidinring)

Histidin: protonierte Form hat Funktion als Base, pKs = 6

Tyrosin: deprotonierte Form hat Funktion als Säure, pKs = 10,1

Histidin kommt häufig im aktiven Zentrum von Proteinen. V.a. wegen der Besonderheiten des Imidazolrestes => so neigt er zur Bildung von H-Brücken, vereinigt Donor- und Akzeptoreigenschaften und kann in eine nukleophilen Katalyse oder in einer Basekatalyse wirksam werden. 

Kurzreichende Abstoßung: Zeichnet sich durch die Van der Waals Radien aus. Man kann die einzelnen Atome in Form eines Hartkugelmodells betrachten, wobei zwie Atome repulsiv wirken wenn sie sich innerhalb der van der Waals Radien befinden.

Van der Waals-Wechselwirkung: Distanzabhängige positive Interaktion zwischen zwie Atomen. Wirkt attraktiv, und kann durch das Lennar-Jones Potential annähernd beschrieben werden.

Elektrostatische Wechselwirkung: Ladungsabhängige Ww. die durch das Coulomb Gesetz beschrieben werden kann. Kann sowohl attraktiv als auch repulsiv sein.

H-Brückenbindung: Attraktive Kraft zwischen zwei Molekülen, wobei eines als Wasserstoff Donor und ein anderes als Wasserstoff Akzeptor fungiert.

Lösungsmittel-Effekte: Löslichkeit von unpolaren Seitenketten is schlecht, von polaren und geladenen Seitenketten higegen gut. Bei Wasser als Lösungmittel kommt es zum Beispiel zu Hydrophoben Ww., da unpolare Gruppen nichtwässrige Umgebung bevorzugen.

Effektive Konzentrationen: Ww. zweier Gruppen innerhalb eines Moleküls hat verringerten Entropieverlust zur Folge. 

Peptidgruppe ist planar.

Carbolylsauerstoff: negative Partialladung

Amid-Stickstoff: positive Partialladung

Bei Prolin (Iminosäure) ist dies erlaubt. Prolin ca. 20% cis im Gleichgewicht, es kann also eine cis-Peptidbindung entstehen.