Proteine: Struktur, Funktion und Engineering
Postranslationale Modifikationen
Postranslationale Modifikationen
Kartei Details
| Karten | 23 |
|---|---|
| Sprache | Deutsch |
| Kategorie | Biologie |
| Stufe | Universität |
| Erstellt / Aktualisiert | 02.04.2021 / 22.07.2024 |
| Weblink |
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Reduktion einer Disulfidbindung durch DDT (Dithiothreitol)
Name der Reakion: Quasi-Einschritt-Reaktion
Weshalb ist DDT ein effizientes Reduktionsmittel?
Entropische Stabilisierung des Produkts aufgrund der energetisch günstigen Zyklisierung => oxidierte Form von DDT ist energetisch stark begünstigt.
Reduktionsmittel der Disulfidbindung (Vor- und Nachteile). Welches davon wird bevorzugt im Sauren eingesetzt?
- Dithiothretiol (DTT)
pH > 7, Thio-Disulfid-Oxidoreduktasen (Dsb-Systeme) und PDI katalysieren diese Reaktion in Bakterien bzw. in höheren Zellen.
- Tris-carboxyethyl-phosphin (TCEP)
nicht membrangängig, stabil gegen Luft-Oxidation, bevorzugt im Sauren eingesetzt, da selektive Reaktion bei pH = 5
- 2-Mercaptoethanol (2 Schritte, schnell bei pH 7)
Reagenz, das zur Quantifizierung von freien Thiolresten allgemein gebräuchlich ist:
- Dithiobisnitrobenzoat, DTNB
Reduktion der Disulfidbindung mit Mercaptoethanol
=> 2-stufige GGW-Reaktion
=> 2-Mercaptoethanol (Thiolat-Form als reaktives Nukleophil)
Eine Cystein-Rest fungiert als Abgangsgruppe und bei der 1. Rektion entsteht ein gemischtes Disulfid => Mercaptoethanol wird nochmal eingesetzt, so dass ein Cystin in 2 freie Cysteine reduziert werden.
Man braucht insgesamt 2 mal Mercaptoethanol.
=> keine Quervernetzung in der Polypeptidkette mehr
=> dann können wir die Länge der Kette bei SDS-PAGE bestimmen
In Abwesenheit von Mercaptoethanol erscheint die Bande kleiner => wegen der Disulfidbindung.
=> Man soll mild alkalische pH haben
Reduktion mittels DTNB (Ellman's Reagenz)
DTT = Dithiolreithol
=> reversible Thiol-Disulfid-Austauschreaktion
=> Quantifizierung von freien Thiolresten über das stöchiometrisch gebildete, gelb gefärbte aromatische Thiolat: NTB = 412 nm
=> pro reagiertem Cystein-Rest wird ein Thiol-Rest freigesetzt
Reduktion mittels TCEP
=> Disulfidbindung wird reduziert
=> benötigt keine basischen pH-Wert
=> selektive Reaktion bei pH 5, stabil gegen Luft-Oxidation
Formulieren Sie die selektive Spaltung einer Peptidkette an einem Methioninrest mit Bromcyan. Bennen Sie dabei entstehende Zwischenprodukt sowie die letztendlich gebildete atypische Aminosäure.
Selektive chemische Reaktion an der Met-Seitenkette, die zur Spaltung der Peptidbindung führt.
- Wichtige Methode zur Spaltung von Proteinen in Peptidfragmente zwecks Sequenzanalyse
Beschreiben Sie die Bildung von Jod-Tyrosin mit Chloramin T (Strukturformel, Zwischenprodukte und gebildete AS) durch radioaktive Jodierung.
Wie heißt diese Reaktion in der Organischen Chemie?
=> chemische Modifizierung von Tyr-Seitenketten
Wie lässt sich Cystein durch selektive chemische Derivatisierung in eine negativ geladene, eine positiv geladene sowie eine ungeladene Seitenkette umwandeln? (Name des Reagenz, Formel des Produktes, Reaktionsmechanismus)
- Positiv geladen: Nucleophile Addition mit Ethylenimin
- Negativ geladen: Carboxymethylierung mit Jodacetat
- Ungeladen: Michael-Addition mit N-Ethylmaleimid
Cys: Reaktionen als Nukleophil
Was ist bei der chemische Derivatisierung der Cystein die eigentliche reaktive Spezies und durch welchen Parameter wird deren Konzentration mitbestimmt?
- Der Cys-Rest ist die reaktive Spezies: Reaktionen als Nukleophil (Thiolat-Anion)
- Bestimmung der Konzentration über den pH-Wert
Formulieren Sie die in der Proteinchemie häufig verwendete Kopplung von Aminogruppen und Carbonsäuregruppen unter Einsatz eines Carbodiimids und von N-Hydroxy-
succinimid. Benennen Sie das Reaktionsprodukt sowie die zwei charakteristischen
Intermediate.
Nennen Sie zwei typische Aminosäureseitenketten, die für diese Reaktion in Frage
kommen.
Chemische Modifizierung von Carboxylat-Seitenketten => Asparaginsäure (Asp) und Glutaminsäure (Glu) können an Amine, wie z.B Lysin gekoppelt werden (nach Aktivierung mit EDC).
Formulieren Sie die Aktivierung von Biotin (unter Vernachlässigung der
Stereochemie) mit EDC als NHS-Ester und dessen regioselektive Kopplung mit der
Lysinseitenkette eines Proteins. Geben Sie ein Proteinreagens an, mit dem sich diese Gruppe hochaffin
komplexieren (oder nachweisen) läßt.
Chemische Modifizierung von Lysin-Seitenketten
Endprodukt bildet einen Komplex mit Streptavidin, welche zum indirekten Nachweis über ein weiteres gekoppeltes Enzym verwendet werden kann.
Welche chemische Gruppe ist zur regioselektiven Markierung von
Cysteinseitenketten allgemein gebräuchlich und wie heißt die entsprechende chemische
Reaktion?
Hierfür kann ein Maleimid verwendet werden. Dafür ersetzt man die Ethylgruppe des Ehtylmaleimids z.B durch Fluorescein aber auch durch Polyethylenglykol um die Cystein Seitenketten nachzuweisen. Die chemische Reaktion bezeichnet man als Michael Addition.
Formulieren Sie ein bispezifisches Reagenz, mit dem man eine Thiolgruppe mit einer
Aminogruppe quervernetzen kann.
Maleimidobutyryloxysuccinimidester
Sie studieren ein bestimmtes Protein. Wie können Sie mit hilfe von Quervernetzung feststellen ob dieses Protein weitere Proteine als starke Wechselwirkungspartner besitzt bzw. mit diesen einen Komplex bildet? Formulieren sie auch die verwendete Reagenz.
Proteinlösung mit DSG (zwei gekoppelte NHS Ester, siehe Bild) verestzen. Es bilden sich aus entropischen Gründen bevorzugt Protein-Protein Bindung aus mit Proteinen die nah beiander liegen bzw einen Komplex bilden. (DSG bindet jeweils die Lysin Ketten der beiden Proteine). Anschließend kann mit Hilfe von SDS Page und Western Blot überprüft werden welche Proteine gebunden wurden.
Wie können Aldehyde verwendet werden um Proteine querzuvernetzen? Formulieren Sie die Reaktion eines Aldehyds zu einem Imin.
Hierfür kann zum Beispiel ein Glutardialdehyd verwendet werden. Dabei reagiert das Aldehyd wie im Bild gezeigt an beiden Seiten mit einer Amidhaltigen Seitekette der beiden Proteine zu einem Imin und stellt so eine Quervernetzung. Das Molekül im Zwischenschritt wird als Schiffsche Base bezeichnet.
Wozu wird Harnstoff bei der biophysikalischen Charakterisierung von Proteinen
verwendet und was sind die beiden relevanten Wirkmechanismen?
Formulieren Sie die proteinchemische Nebenreaktion, die dabei zu befürchten ist.
Durch welche beiden einfachen Maßnahmen kann man diese verhindern?
Harnstoff kann zur Denaturierung von Proteinen verwendet werden, z.B auch für Renaturierungs/Denaturierungsstudien. Außerdem hilf Harnstoff bei der Rückfaltung von rekombinanten Proteinen aus Enschlusskörpern. Die Wirkmechanismen sind dabei, das Aufbrechen von H-Brücken und die Erhöhung der Löslichkeit Hydrophober Reste.
Als Nebenreaktion ist jedoch eine Rückreaktion (wenn auch nur mit geringer Geschwindigkeitskonstante) des Harnstoffs zu Cyanat zu befürchten. Das entstehende Cyanat geht dann ungewollte Bindungen mit der NH2 Gruppe von Lysin ein. Das Probelm tritt also vor allem bei älteren Harnstofflösungen auf bei denen sich das GGW bereits vollständig eingestellt hat.
Diese Nebenreaktion kann zum einen durch das verwenden von frischem Harnstoff bei dem sich noch so gut wie kein Cyanat gebildet hat verhindert werden. Zum anderen kann auch eine ältere Harnstofflösung verwendet werden und mit einem Mischbettionenaustauscher versetzt werden welche das Cyanat bindet.
Welches alternative Reagens zum Harnstoff wird heute verwendet? Welche Vorteile und Nachteile hat es im Vergleich zum Harnstoff?
Guanidiniumchlorid wird heutzutage verwendet.
Vorteil: Stärkeres Denaturierungsmittel, keine Cyanatbildung die zu unerwünschten Lysinbindungne führt
Nachteil: Teurer als Harnstoff, schwieriger zu entsorgen, schlecht kompatibel mit SDS Page
Wie lassen sich Lysinseitenketten quantifizieren? Formulieren sie die Reaktion und bennen sie das verwendete Reagenz.
Hierfür kann Trinitrobenzol-sulfosäure (TNBS) verwendet werden. Dabei bindet dieses gelbliche Molekül durch nukleophile Substitution am Aromaten die Lysin Seitenkette und verändert seine Farbe zu rot. Über die Absorption bei 367, kann dann das Lysin quantifiziert werden.
Formulieren Sie die Bildung einer Isopeptidbindung anhand einer Asn-Gly-Sequenz.
Der Weg auf der linken Seite führt zu einem Isopeptid. Führt in der Regel zur Denaturierung.
Formulieren sie die proteinchemische Reaktion zur Inaktivierung der RNase.
Es befinden sich zwei His Resete im aktiven Zentrum der RNase. Diese könne nmit Hilfe von DEPC (Diethylpyrocarbonat) inaktiviert werden.
Formulieren Sie die proteinchemische Reaktion mit der man Trypsin inaktivieren kann.
Trypsin ist eine Serinprotease, d.h zur inaktivierung kann das Serin im aktiven Zentrum inaktiviert werden. Dies kann zum Beispiel durch Dehydratisierung geschehen. Hierfür wird Phenylmethansufonylfluorid (PMSF) verwendet.
Was ist das analoge physiologische Thiolreagenz in vivo?
- PDI (Proteindisulfidisomerasen)
- GSH (Gluthathion)
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