Proteine: Struktur, Funktion, Engineering

Fragestellung: Wie viele unterschiedliche Proteine gab's während der Lebensdauer des Planeten (4 Mrd.)? 

• Dichte E. coli Kultur + Bakteriophagen (nicht-lysierend) 
• hohe Mutationsfrequenz => jede Phage kodiert für ein neues Protein => 10^55 unt. Proteine
• vgl. Polypeptid mit 200 AS => 10^260 Sequenzkombinationen 
• die meisten kombinatorisch möglichen Proteine werden in Natur nicht synthetisiert

=> Fähigkeit zur Faltung spielt eine Rolle

=> nicht alle theoretisch mögliche Seqeunzen sind fähig zur Faltung 

• Es gibt 2.000.000? verschiedene Faltungstypen, die bis jetzt bekannt sind 
• pro Faltungstyp gibt es viele Variationen und Mutationen

• (Oligo-) Peptide 

kurze Kette (30-50 AS), definierte Sequenz, keine definierte Struktur

=> keine höhere Eigenschaften, wie Katalyse (kein bestimmte Raumstruktur) 

• Polyaminosäure 

entsteht durch Polymerisation aus einer oder wenigen unt. AS, zufällige Sequenz, variierende Länge

• Polypeptid

längere Kette, definierte Sequenz 

• Protein

Polypeptid mit definierter Raumstruktur (Faltung) => biochemische Funktion, z.B. Katalyse, Bindungsfunktion für die Liganden usw. 

Ohne Faltung verliert das Protein die biochemische Funktionen. 

Primärstruktur

• kovalente Struktur, d.h. AS-Sequenz 

sowie ggf. Disulfidbindungen und posttranslationale Modifikationen (Glycosylierung, Phosphorylierung, Disulfidbrücken durch Oxidation zw. Cysteinresten => Quervernetzung der AS-Sequenz) 

"konjugierte" Proteine: Protein kovalent verbunden mit einer prosthetischen Gruppe, z.B. Häm bei Hämoglobin oder bei Cytochrom

Sekundärstruktur

• lokale (periodische) Konformation des Rückgrats, v.a. α-Helix, β-Faltblatt (auch "Turns"/Schleifen)

=> Reste der alpha-Helix od. ß-Faltblatt haben immer periodisch wiederkehrende Konformation, welche zur großen Konformation des Rückgrats führt. 

Supersekundärstruktur: stabile Anordnung aus Sekundärstruktur-Elementen, besonders symmetrisch, z.B. Coiled coils oder ß-Barrel 

Tertiärstruktur

• vollständige Raumstruktur eines Polypeptids (Sekundärstruktur + extra Elemente)

Domäne: klar umrissene und i.d.R. stabil gefaltete Struktureinheit

Quartärstruktur

• räumliche Anordnung von Untereinheiten bei oligomeren Proteinen (aus mehreren Tertiärstrukturen)

=> viele DNA-bindende Proteine und Restriktionsenzyme sind Dimere (wegen der doppelsträngigen Natur der DNA) 

Die Aminogruppe der α-Aminosäuren befindet sich am zweiten Kohlenstoffatom, einschließlich des Carboxy-Kohlenstoffatoms. Die Zählung beginnt immer mit dem Carboxy-Kohlenstoff. Die IUPAC-Bezeichnung lautet daher 2-Aminocarbonsäuren. Der einfachste Vertreter der α-Aminosäuren ist die proteinogene Aminosäure Glycin. Alle proteinogenen Aminosäuren sind α-Aminosäuren.

Das stark elektronegative Sauerstoffatom zieht das gemeinsame Elektronenpaar zu sich, wodurch der Kohlenstoff seine Vierbindigkeit einzubüßen riskiert. Dieses entzieht nun wiederum dem benachbarten Stickstoffatom das freie Elektronenpaar. Dadurch entsteht zwischen dem CO- und dem NH-Anteil der Peptidbindung zeitweise eine Doppelbindung. 

Konsequenzen: 

1. Der Abstand zwischen den Atomen (C und N) ist kleiner als bei einer Einfachbindung, aber größer als bei einer richtigen Doppelbindung. 
2. Die sonst für normale Einfachbindungen übliche freie Drehbarkeit geht verloren, was für die Konformation der späteren Proteine von großer Bedeutung ist.
3. Die Peptidbindung ist eine planare Bindung, d.h. die beteiligten Atome (-CO-NH-) liegen in einer Ebene, und zwar in trans-Stellung (guckt O nach oben, schaut H nach unten und umgekehrt).

Wenn diese Eigenschaft nicht gäbe, dann könnten sich die Proteine nicht falten.

C-N: 1,33 Angström vgl. C(alpha)-N: 1,45 Angström

C(alpha)-C(alpha): 3,8 Angström

Die Amino-Gruppe der einen Aminosäure kann nun mit der Carboxyl-Gruppe einer anderen Aminosäure reagieren. Dabei wird Wasser abgespalten und eine Peptidbindung geknüpft. Weil dabei die OH-Gruppe einer Carboxyl-Gruppe durch eine NH2-Gruppe ersetzt wird, spricht man von einem Säureamid (-CO-NH-) und bezeichnet die Peptidbindung daher auch als Säureamidbindung. 

Das Gleichgewicht für das Entstehen einer Peptidbindung liegt deutlich auf der Seite der freien Aminosäuren. Das bedeutet, dass für die Biosynthese von Peptidbindungen Energie benötigt wird, während ihre Spaltung thermodynamisch freiwillig abläuft.

=> Peptidbindung kann aber zu freien AS (energetisch günstiger) hydrolisieren ohne Energiezufuhr, einzige was nötig ist die Katalyse, da die Amidbindung metastabil ist (lässt sich sehr langsam umsetzen im Wasser) => schneller geht’s wenn man stark ansäuert oder im RT mit Protease.

(In Ribosom wird auch ATP benötigt für die Peptidbindung)

=> Proteine sind metastabil, wegen der Säureamidbindung

• Prolin

Seitenkette faltet zur Aminogruppe zurück (wird somit zyklisch), somit hat Prolin keine freie Aminogruppe, sondrn eine Iminogruppe

• Glycin 

nicht chiral => keine 4 unt. Substituenten, somit bekommt es eine Spiegelebene

Bei cis-Peptidbindung sind O (von CO-Bindung) und H (von NH-Bindung) auf der selben Seite und bei trans-Peptidbindung sind diese in umgekehrten Anstellung zu finden. 

Prolin hat aber eine zyklische Seitenkette => deswegen sterisch keine gravierenden Unterschied zw. trans- und cis-Stellung. 20% der Proline sind im cis-Konfiguration. 

Wenn man Prolin mit Alanin tauscht => bricht die ganze Faltung zusammen, da die Alanin-Rest keine cis-Konfiguration einnehmen kann.

Annahme: Alle AS werden in Ribosom trans eingebaut, erst wenn die Polypeptidkette raus von Ribosom ist, nimmt Prolin die cis-Konfiguration. 

Sie katalysieren die Bindungsachsenrotation von Amid-Bindungen in Proteinen, an denen die Aminosäure Prolin beteiligt ist. Diese Reaktion ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Proteinfaltung.

Die cis-Konformation ist hauptsächlich zu beobachten, wenn Prolin an einer Peptidbindung beteiligt ist. Diese Bindung kann sowohl in der trans- als auch in der cis-Konfiguration vorliegen, ein Wechsel zwischen beiden Konfigurationen findet nur langsam statt. Dies hängt mit der cyclischen Struktur des Prolin-Moleküls zusammen, bei der die Aminogruppe neben dem zentralen C-Atom (α-C-Atom) auch mit der Seitenkette der Aminosäure verbunden ist, was bei keiner weiteren proteinogenen Aminosäure der Fall ist.

Die spezifische Proteinfaltung von solchen Proteinen kann daher nicht selbständig spontan ablaufen. Die Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerasen wirken hier als Faltungshelfer. Die Enzyme sind in der Lage, zwischen der cis- und der trans-Konfiguration der jeweiligen Peptidbindung zu schalten, so dass sich das Protein korrekt faltet und erst dann seine Funktion erfüllen kann. Dabei können sowohl cis- als auch trans-Konfigurationen entstehen.