Proteine
Struktur, Funktion, Engineering
Struktur, Funktion, Engineering
a-Helix
- phi, psi Winkel sind vereinbar mit den meisten AS
- H-Brücke zw C=O von ASi mit N-H von ASi+4 (Nahordnung)
- 5,4 Å pro Windung
- in Proteinen leicht abweichende Geometrie, statistische präferenz für einzelne AS
- Ala hat stärkste Tendez zur Bildung der Helix
- An cß verzwigte AS weniger günstig
- Pro führt zur störung der Geometrie (Helixbrecher)
- N/C Cap: Asn und Gln sättigen über ihre SK die offenen H BB DOnoren und Akzeptoren
- elektrostatische Besonderheit: Parallele Ausrichtung der Peptidgruppen.> Makrodipolmoment 0,5-0,7. Elementarladungen an der Enden
Serum Albumin
ß-Faltblatt
Bsp Protein
- Basiseinheit ß Strang
- Anordnung parallel oder antiparallel (stabiler) mit H BB Netzwerk dazwischen
- natürliche ßFB sind verdrillt
- Fernordnung: in der 1ärstruktur entfernte AS werden räumlich zusammengestellt - Rolle der Turns
Immunglobulin, ß-Keratin
Energetik einer Proteinfaltungsreaktion nach dem Zweizustandsmodell
mit N (native), U (unfolded), f(u) (fraction unfolded)
Zusammenhang mir freien Enthalpie: Vant Hoffsche Gleichung
Hitze Denatutierungskurve
wodurch kooperativität bemerkbar, Parameter
Sigmoidalen Kurvenverlauf
Parameter m (Kooperativitätsparameter)
Gleichung der Observablen
Allosterie
änderung der Konformation der Struktur des Moleküñs unter dem Einfluss sich anlagernden niedermolekularen Verbindungen.
Bildung Isopeptidbindung anhand Asn-Gly sequenz
Isopeptidbindung
Amidbindung zw seintenständige e-Aminogruppe von L-Lysin und seitenstäntige Carboxygruppe von L-Asparaginsäure.
die Verknüpfung der AS erfogt also nicht über a-ständige Amino und Carboxylgruppen.
freie Transferenergie
Energieunterschied des Wechsels von einem Medium in das andere zB von purem Wasser in Lösung des Ko Solvens in Wasser der Proteins
Harnstoff
De und Renaturierungsstudien, Rückfaltung von Rekombinanten Proteinen aud einschlussekörpern
Wirkmechanismen: AUfbrechen von H-Brücken, Erhöhung der Löslichkeit hydrophober Reste
Reaktion verhindern durch:
- Ernierdrigung des pH, sodass Lys zunehmend Protoniert und damit weniger reaktiv vorliegt (nicht mehr als Nukleophil)
- Ammonium zum Puffer geben, damit sich das GGW auf Seiten des Harnstoffs verschiebt
alternatives Reagenz, stabiler: Gusnidiniumchlorid
Denaturierungmittel
Harnstoff kann sich zu cyanat und ammonium zersetzen (8M benötigt)
Guanidiniumchlorid hat die stärkere Wirkung (6M reichen)
T4 Lysozym
- besitzt keine Disulfidbindungen
- Synthese im reduzierenden Cytoplasma
- kein sekretorisches Enzym
- zwei natürliche freie Thiolreste: Cys 97, Cys54
1. Fallbeispiel: Engineering von Disulfidbindungen
Substitution Ile3 durch Cys
Mutante zeigt erhöhte thermische Stabilität, ist eine Folge der kovalenten Quervernetzung innerhalb der polypeptidkette.
Oxidierte Form immer stabler als reduzierte Form
Die beiden effektivsten Disulfidbindungen 9-164 und 12-142 umspannen jeeils einen großen Bereich der Polypeptidkette (Schleifenumfang), und sie fixieren eine flexible Region in der 3ärstruktur.
Nachtrag: Flexibilität in der Proteinlösung
- Geometrisches Problem: Abstand zw 21 und 142 eig. zu groß, allerding Flexibilität besteht.
2. Fallbeispiel: Löcher in Proteine und hydrophobe Packung
Versuch zur Verbesserung der AS-Packung im T4 Lysozym zwecks Verständnis der Rolle der "hydrophoben Kerns" und evtl. erhöhung der (Thermo)stabilität des Proteins
- Fokusierung auf hydrophoben Effekt: Packung unpolarer SK im Proteininneren
- Abschätzung aus den Freien Transferenergien der hydrophoben AS: ≈ 24 cal/ mol*Å^2 -> AS-Substitutionen, die diesen Betrag erhöhen, sollten daher die Proteinstabilität verbessern, sofern sie keine sterische Spannung erzeugen. (Begrabene OberflÄche hoch, Stabilität hoch)
- Prüfung der Kavität:
- Eine kleinere SK soll sich durch eine größere ersetzen lassen
- Die neu eingefügte SK sllte keine Kontakte <3,2Å mit ihrer Umgebung eingehen
- Die SK-Diederwinkel sollten denen in hoch aufgelöste Proteinstrukturen entsprechen
- Des auszutauschende Rest sollte eine Solvesexponierte Oberfläche = 0 besitzen
Schlussfolgerungen 2. Fallbsp
Die Packungsdichte innerhalb eines Proteins kann ehöht werdenan viele stellen im Bereich der ausgetauschten AS treten sterische Spannungen auf aufgrund leichter Überlappung von VdW Radien mit benachbarte Reste
Die Summe aus der ungünstigen Stereochemie resultierende Spannungsenergien (VdW und DIederspannung) überwiegt ggü der hydrophoben Stabilisierung
Der sehr beschränkte Satz der durch den genetischen Code erlaubten hydrophoben SK gestattet nur begrenzte Optimierung der AS-Packung in Proteinen.
Engineering des subtilisins durch Veränderungen am aktiven Zentrum der Proteinstruktur unter Substitution gegen Alaninreste
- Welche 3 AS spielen bei der hydrolyse des Peptidsubstrates eine zentrale Rolle und welchen übergeordneten Begriff hat man dafür?
- Zu welcher Enzymklasse gehört subtilisin, welches mechanistisch damit verwandte Enzym kennen Sie und in welcher Beziehung stehen die beide miteinander?
- Welcher spezieller Schritt ist bei diesen Proteinen notwendig, um letzendlich zum gewünschten Genprodukt zu kommen; welchen Trick hat man bei den Mutanten des Subtilisins angewandt und was musste man bei der Reinigungg beachten?
- Reaktionsmechanismus zur Hydrolyse der Peptidbindung und benennen die 4 wichtigsten Stadien dabei.
- Wesentliche Aussage aus dieser Protein Engineering Studie
- Katalytische Triade: Ser221, His64, Asp32
- Klasse der Hydrolasen, Subklasse der Endoproteasen, Familie der Serin Proteasen. Enzymatischer Mechanismus: katalytische Hydrolyse der Peptidbindung, typisch für Serinproteasen: Katalystische Triade nahezu identische Anordnung mit Trypsin bei unterschiedlicher Faltung. -> Bsp für kovergente Evolution
- Produktion der rekombinanten Varianten in transformierten und enzymdefizienten B.subtilis Zellen in ggw eines B subtilis WT Stamms zwecks Maturierung des Präproezyms. Trick: Reinigung aus dem Kulturüberstand und Abtrennung vom WT Enzym mittels Thiol-Separose anhand der zusätzlich eingeführten Mutation S24C-> Oberflächenexponierter cys Rest
- Bild
- Im Gegensatz zu REsten, die an der Substratbindung beteiligt sind, wird v.a. die Wechselzahl dramatisch erniedrigt , wohigegen die Michaelis Konstante nur wenig beeinflusst wird. Weitere Reaktionsbeschleunigung um Faktor 1000 durch Reste, die den übergangszustand stabilisieren. Bei S221A kann kein Acylenzym-Intermediat gebildet werden, sodass H2O direkt als Nukleophil wirkt. Die reste de Triade agieren stark synergistisch und beschleunigen nur zusammen die Substrat-Hydrolyse
Wahl zw Met und Leu
Weche is chemisch instabiler?
Met: Flexibler, aber reaktiver
Leu: nicht so reaktiv, aber schwierige statik durch hydrophobe WW
Methionin ist instabiler wegen unverzweigter Struktur; Flexibilität der SK liefert einen entropisch ungünstiegen Beitrag zur Proteinfaltung. S ist reaktiver als die Methylgruppe des Leucins.
Engineering des T4 Lysozyms durch Einfügung von Löchern in die Proteinstruktur unter Substitution von Leu gegen Ala
- Durch welche 2 Parameter wird der destabilisierender Effekt quantitativ bestimmt.
- einer dieser Parameter lässt sich mit 2 unterschiedlichen geometrischen Eigenschaften in ähnlicher Weise korrelieren. Benennen.
- Praktische Bedeutung der Proteinfaltung
- Methode, mit der sich der andere Parameter an isolierten AS bzw geeigneten Derivaten messen lässt.
- Kavität, Unterschied Freien Transferenrgien
- Kavität: a) ∆∆G = -1,9 kcal/mol * Å2 *∆V (Volumen) b) ∆∆G = -1,9 kcal/mol * Å2 *∆S (Oberfläche)
- Verkleinert man die Kavität, ohne dabei die Freiein Transferenergien der AS negativ zu beeinflussen oder ungünstige sterische WW auszulösen, dann sollte dies die Proteinstabilität verbessern.
- Hydrophobie: mit ∆G = -RTlnK des Verteilungskoeffizienten zB Wasser-> Octanol. Stark von Bedingungen abhängig
- Positive und negative effekte durch einfügung Cystein.
- Proteinchemische Reaktion unter Wahl eines passenden Reaktionspartners.
- Energieschema, Stabilisierung
- Welche beide gegenläufige Effekte sind zu berücksichtigen, wenn man hydrophobe SK mit untersch. größe gegeneinander austauscht?
- Weshalb ist der Austausch mit Ala so gut geeignet, um funktionell wichtige AS in einem Protein zu identifizieren?
- Welche vor und Nachteile bietet Methionin beim Packen einer ydrophoben Kernregion?
- T4 Lysozym besitzt 4 SS Bindungen. Geben an, wie viele Disulfidisomere nach der REnaturierung theoretisch maximal entstehen können. Herleitung.
1.
- Positiv:
- Erhöhung der thermischen Stabilität durch kovalente Qervernetzung innerhalb der Polypeptidkette bei der oxidierten Form der Mutante
- Kontrolle der Enzymaktivität über das Redoxpotential, wenn eine Disulfidbrücke eingeführt wird, die die Furche des aktive zentrum überbrückt und somit den Zugang für das Substrat sterisch hindert.
- Negativ:
- Die reduzierte Form der Mutante ist weniger stabil als der WT, da die Einführung der Cys-Reste andere wichtige WW unterbricht.
- Sterische Hinderung des akt Zentrums
- fixierung flexiber Regionen in der 3ärstruktur
2. ?
3. Entropische destabilisierung des entfalteten Zustands; Erniedrigung von ∆Sconf der random coil durch kovalente Quervernetzung. bild
4.
- Es gibt Kavitäten, die mit größeren Resten gefüllt werden können. Die Packungsdichte eines Moleküls kann also erhöht werden-> satibilierend (Die Füllung der Kavität kann aber auch leich eine Überpackung darstellen und nicht stabilisieren wirken)
- Durch den Austausch hydrophober SK können neue Kavitäten geschaffen werden oder bestehende vergrößert werden -> destabilisierend
- die Aufnahme von Bezol als einfaches Seitenkettenanalogon für Phe in den Hohlraum und Bindung führt zu einer Verkleinerung der Kavität. Hydrophobe Kavitätten lassen sich zur Aufnahme von Liganden durch Protein Engineering quasi maßschneidern.
5. Vereinfachte Analyse des Wegfalls eines großen Teils der SK: Ala besitzt nur funktionell weitgehend neutrale Methylgruppe; wird eine funktionelle AS gegen Ala ausgetauscht, hat dies idR einen Verlust der Proteinfunktion zur Folge.
6. Vorteile: hohe Flexibilität der linearen SK (Anpassungsmöglichkeiten an sterische Randbedingungen), ähnlicher Raumbedarf wie Leucin, Isoleucin, Phe
Nachteile: geringere Transferenergie, Seitenkettenflexibilität liefer einen entropisch ungünstigen Beitrag zur Proteinfaltung und könnte zur Bildug einer molten globule Struktur Führe, instabiler als AS mit verzweigter SK, relativ reaktiv
7.
Öltröpfchenmodell
Zusammenlagerung unpolarer Moleküle in Wasser und wässrigen Lösungen, da Wassermoleküle in der direkten Nachbarschaft keine H-Brücken zu unpolaren Molekülen ausbilden können und sich so untereinander etwas stärker binden. → Hydrophober Effekt
Acyl-Enzym-Ziwschenprodukt
Stadium bei der Hydrolyse einer Peptidbindung (katalytische Triade): Serin im aktiven Zentrum verbunden mit Carboxyterminus der gespaltenen Peptidbindung, Aminogruppe ist bereits abgespalten
Substrat assisted catalysis
ist der Prozess, bei dem eine der funktionellen Gruppen, die benötigt werden, um ein Enzym aktiv zu machen, durch das Substrat und nicht durch das Enzym selbst bereitgestellt wird.
Entfernt man Histidin aus der katalytischen Triade Asp, His, Ser der Serinprotease Subtilisin und ersetzt es durch Alanin, wird das Enzym inaktiviert. Die Modifikation des Substrats, so dass es das His in der richtigen Position liefert, wenn das Enzym das Substrat bindet, reaktiviert das Enzym, und es kommt zur Proteolyse
His-SK an P2 des Substrats kann die Imidazolgruppe der katalytischen Triade sterisch beinahe perfekt ersetzen-> Substrat N-succinyl-Phe-Ala-His-Phe-pNitrpnailid wird bei pH 8 um den Faktor 400 schneller Hydrolysiert als das Substrat mit P2 Ala oder P2 Gln. Strategie zum Engineering von Proteasen mit besonders enger Substratspezifität.
Aufgaben von Proteinen
- Abwehr (Immunglobuline)
- Bindung (Enzyminhibitoren)
- Elektronentransport (Atmungskette, Photosynthese)
- Mechanik (Actin, Myosin)
- Membrankanäle (Transporter)
- Reaktionskatalyse (Enzyme)
- Regulation (Hormone)
- Stofftransport (Hämoglobin)
- Struktur (Kollagen)
- Speicherung (Casein)
- Signaltransduktion (Membranrezeptoren)
Oligo-Peptid
kurze Kette, definierte Sequenz, keine definierte Raumstruktur -> Eigenschaften ergeben sich aus Summe der AS
Einzelne AS Einheit
Polyaminosäure
durch Polymerisation aus einer oder wenigen unterschiedlichen AS, zufällige Sequenz, variierende Länge
Wichtig bei Grundageforschung
Längere Kette, definierte Aminosäure-Sequenz
(natürliches) Polypeptid mit definierte 3D Struktur -> biochemische Funktion
kovalente Struktur, d.h. AS-Sequenz, sowie ggf. Disulfidbrücken und posttranslationale Modifikationen
- Konjugierte Proteine: prosthetische Gruppen (z.B. Coenzym 1)
lokale (periodische) Konformation des Rückgrats v.a. a-Helix, ß-Faltblatt
- Supersekundärstruktur: stabile Anordnung aus Sekundärstruktur- Elementen (z.B. Coiled Coils)
Tertiärsrtuktur
vollständige Raumstruktur eines Polypeptids (also eine UE) mit Wdv, Ionische WW zB Subtilisin
- Domäne: klar umrissene und in der regel stabil gefaltete Struktureinheiten (zB Zink-Fingerdomäne
Quartiärstruktur
räumliche anordnung von Untereinheiten bei oligomeren Proteinen
Aufbau aus einzelnen polypeptidketten als UE (Monomere): Hämoglolbin, Streptavidin
die Grenzflächen ähneln der Packung in Inneren globuläre Proteine
bei identische monomere: zklische oder diedrische Symmetrie
Konsequenz: allosterie, unabh. davon auch Avidität
Proteinentwicklung unter günstigsten Annahmen
100 As
- Planet bedeckt mit Ozean (4 km tief): 1,2 * 10^18 m^3
- Darin dichte Kultur von E.coli, infiziert mit Bakteriophage M13
- maximale Replikationsrate: 3 Generationen pro Stunde
- hohe Mutationsfrequenz: jede Bakterie codiert für 1 neues Protein -> 10^55 unterschiedliche Proteine
- vgl. Polypeptid mit 20 AS: 20^200 = 10^260 Sequenzkoombinationen
- d.h. 10^260 - 10^55 = 10^260 Proteine wurden in der Natur niemals synthetisiert
Polypeptid mit 100 As
- 20^100 = 10^130 Sequenzkombinantionen
- 10^130-10^55 Proteine wurden niemals synthetisiert
- 55: 1,3 = 42 As
Peptidbindung
- Partieller Doppelbindungscharakter
- C-N: 1,33 Å (vlg. Ca-N: 1,45 Å --> Doppelbindungscharakter)
- Ca-Ca: 3,8 Å (für alle trans-Peptidbindungen)
- Das thermodynamische GGW liegt auf Seite der Hydrolyse
- Extreme des Peptids: Carbonyl Sauerstoff: Negative partialLadnug; Amid.Stickstoff: Positive partialLadung
Aliphatische Aminosäuren
- Glycin
- Alanin
- Valin
- Leucin
- Isoleucin
- Prolin
Glycin
Gly
G
Nicht chiral da keine Seitenkette. Erlaubte Region im Ramachandran Plot größer
Alanin
Ala
A
durchschnittlichste aller AS, beim Austausch führt nicht zum Verlust der Faltung, aber Verlust der Funktion
Valin
Val
V
Isopropylgruppe
verwendet im hydrophoben inneren des Proteins
Leucin
Leu
L
Sehr häufig im inneren
Isobutyl Seitenkette
Verzweigte Struktur, stabilisiert durch spezifische hydrophobe WW -> sterische Problematik
Ganz hydrophob, voll apolar
Isoleucin
Ile
I
Besitzt 2ter chirales Zentrum.
Es giibt 4 chirale zentren aber in proteinogene AS kommt nur 2S und 3S vor
Prolin
Pro
P
Omega Winkel von 0 Grad erlaubt.
Iminosäure (Pyrrolidinring). Seitenkette im Ringschluss mit Stickstoff verbunden.
Aliphatisch, unpolar, hydrophob
geometrichen FG? Proliin ca 20% cis im GGW. Durch Bindungsbruch, welcher von ein Enzym katalysiert wird, und nciht durch Drehung. Sterische hinderung ist bri Pro geringer als bei anderen AS.
Thiol Seitenketten
- Methionin
- Cystein
-
- 1 / 88
-
Lernkarten
Schlussfolgerungen 2. Fallbsp
Die Packungsdichte innerhalb eines Proteins kann ehöht werdenan viele stellen im Bereich der ausgetauschten AS treten sterische Spannungen auf aufgrund leichter Überlappung von VdW Radien mit benachbarte Reste
Die Summe aus der ungünstigen Stereochemie resultierende Spannungsenergien (VdW und DIederspannung) überwiegt ggü der hydrophoben Stabilisierung
Der sehr beschränkte Satz der durch den genetischen Code erlaubten hydrophoben SK gestattet nur begrenzte Optimierung der AS-Packung in Proteinen.
Engineering des subtilisins durch Veränderungen am aktiven Zentrum der Proteinstruktur unter Substitution gegen Alaninreste
- Welche 3 AS spielen bei der hydrolyse des Peptidsubstrates eine zentrale Rolle und welchen übergeordneten Begriff hat man dafür?
- Zu welcher Enzymklasse gehört subtilisin, welches mechanistisch damit verwandte Enzym kennen Sie und in welcher Beziehung stehen die beide miteinander?
- Welcher spezieller Schritt ist bei diesen Proteinen notwendig, um letzendlich zum gewünschten Genprodukt zu kommen; welchen Trick hat man bei den Mutanten des Subtilisins angewandt und was musste man bei der Reinigungg beachten?
- Reaktionsmechanismus zur Hydrolyse der Peptidbindung und benennen die 4 wichtigsten Stadien dabei.
- Wesentliche Aussage aus dieser Protein Engineering Studie
- Katalytische Triade: Ser221, His64, Asp32
- Klasse der Hydrolasen, Subklasse der Endoproteasen, Familie der Serin Proteasen. Enzymatischer Mechanismus: katalytische Hydrolyse der Peptidbindung, typisch für Serinproteasen: Katalystische Triade nahezu identische Anordnung mit Trypsin bei unterschiedlicher Faltung. -> Bsp für kovergente Evolution
- Produktion der rekombinanten Varianten in transformierten und enzymdefizienten B.subtilis Zellen in ggw eines B subtilis WT Stamms zwecks Maturierung des Präproezyms. Trick: Reinigung aus dem Kulturüberstand und Abtrennung vom WT Enzym mittels Thiol-Separose anhand der zusätzlich eingeführten Mutation S24C-> Oberflächenexponierter cys Rest
- Bild
- Im Gegensatz zu REsten, die an der Substratbindung beteiligt sind, wird v.a. die Wechselzahl dramatisch erniedrigt , wohigegen die Michaelis Konstante nur wenig beeinflusst wird. Weitere Reaktionsbeschleunigung um Faktor 1000 durch Reste, die den übergangszustand stabilisieren. Bei S221A kann kein Acylenzym-Intermediat gebildet werden, sodass H2O direkt als Nukleophil wirkt. Die reste de Triade agieren stark synergistisch und beschleunigen nur zusammen die Substrat-Hydrolyse
Wahl zw Met und Leu
Weche is chemisch instabiler?
Met: Flexibler, aber reaktiver
Leu: nicht so reaktiv, aber schwierige statik durch hydrophobe WW
Methionin ist instabiler wegen unverzweigter Struktur; Flexibilität der SK liefert einen entropisch ungünstiegen Beitrag zur Proteinfaltung. S ist reaktiver als die Methylgruppe des Leucins.
Engineering des T4 Lysozyms durch Einfügung von Löchern in die Proteinstruktur unter Substitution von Leu gegen Ala
- Durch welche 2 Parameter wird der destabilisierender Effekt quantitativ bestimmt.
- einer dieser Parameter lässt sich mit 2 unterschiedlichen geometrischen Eigenschaften in ähnlicher Weise korrelieren. Benennen.
- Praktische Bedeutung der Proteinfaltung
- Methode, mit der sich der andere Parameter an isolierten AS bzw geeigneten Derivaten messen lässt.
- Kavität, Unterschied Freien Transferenrgien
- Kavität: a) ∆∆G = -1,9 kcal/mol * Å2 *∆V (Volumen) b) ∆∆G = -1,9 kcal/mol * Å2 *∆S (Oberfläche)
- Verkleinert man die Kavität, ohne dabei die Freiein Transferenergien der AS negativ zu beeinflussen oder ungünstige sterische WW auszulösen, dann sollte dies die Proteinstabilität verbessern.
- Hydrophobie: mit ∆G = -RTlnK des Verteilungskoeffizienten zB Wasser-> Octanol. Stark von Bedingungen abhängig
- Positive und negative effekte durch einfügung Cystein.
- Proteinchemische Reaktion unter Wahl eines passenden Reaktionspartners.
- Energieschema, Stabilisierung
- Welche beide gegenläufige Effekte sind zu berücksichtigen, wenn man hydrophobe SK mit untersch. größe gegeneinander austauscht?
- Weshalb ist der Austausch mit Ala so gut geeignet, um funktionell wichtige AS in einem Protein zu identifizieren?
- Welche vor und Nachteile bietet Methionin beim Packen einer ydrophoben Kernregion?
- T4 Lysozym besitzt 4 SS Bindungen. Geben an, wie viele Disulfidisomere nach der REnaturierung theoretisch maximal entstehen können. Herleitung.
1.
- Positiv:
- Erhöhung der thermischen Stabilität durch kovalente Qervernetzung innerhalb der Polypeptidkette bei der oxidierten Form der Mutante
- Kontrolle der Enzymaktivität über das Redoxpotential, wenn eine Disulfidbrücke eingeführt wird, die die Furche des aktive zentrum überbrückt und somit den Zugang für das Substrat sterisch hindert.
- Negativ:
- Die reduzierte Form der Mutante ist weniger stabil als der WT, da die Einführung der Cys-Reste andere wichtige WW unterbricht.
- Sterische Hinderung des akt Zentrums
- fixierung flexiber Regionen in der 3ärstruktur
2. ?
3. Entropische destabilisierung des entfalteten Zustands; Erniedrigung von ∆Sconf der random coil durch kovalente Quervernetzung. bild
4.
- Es gibt Kavitäten, die mit größeren Resten gefüllt werden können. Die Packungsdichte eines Moleküls kann also erhöht werden-> satibilierend (Die Füllung der Kavität kann aber auch leich eine Überpackung darstellen und nicht stabilisieren wirken)
- Durch den Austausch hydrophober SK können neue Kavitäten geschaffen werden oder bestehende vergrößert werden -> destabilisierend
- die Aufnahme von Bezol als einfaches Seitenkettenanalogon für Phe in den Hohlraum und Bindung führt zu einer Verkleinerung der Kavität. Hydrophobe Kavitätten lassen sich zur Aufnahme von Liganden durch Protein Engineering quasi maßschneidern.
5. Vereinfachte Analyse des Wegfalls eines großen Teils der SK: Ala besitzt nur funktionell weitgehend neutrale Methylgruppe; wird eine funktionelle AS gegen Ala ausgetauscht, hat dies idR einen Verlust der Proteinfunktion zur Folge.
6. Vorteile: hohe Flexibilität der linearen SK (Anpassungsmöglichkeiten an sterische Randbedingungen), ähnlicher Raumbedarf wie Leucin, Isoleucin, Phe
Nachteile: geringere Transferenergie, Seitenkettenflexibilität liefer einen entropisch ungünstigen Beitrag zur Proteinfaltung und könnte zur Bildug einer molten globule Struktur Führe, instabiler als AS mit verzweigter SK, relativ reaktiv
7.
Öltröpfchenmodell
Zusammenlagerung unpolarer Moleküle in Wasser und wässrigen Lösungen, da Wassermoleküle in der direkten Nachbarschaft keine H-Brücken zu unpolaren Molekülen ausbilden können und sich so untereinander etwas stärker binden. → Hydrophober Effekt
Acyl-Enzym-Ziwschenprodukt
Stadium bei der Hydrolyse einer Peptidbindung (katalytische Triade): Serin im aktiven Zentrum verbunden mit Carboxyterminus der gespaltenen Peptidbindung, Aminogruppe ist bereits abgespalten
Substrat assisted catalysis
ist der Prozess, bei dem eine der funktionellen Gruppen, die benötigt werden, um ein Enzym aktiv zu machen, durch das Substrat und nicht durch das Enzym selbst bereitgestellt wird.
Entfernt man Histidin aus der katalytischen Triade Asp, His, Ser der Serinprotease Subtilisin und ersetzt es durch Alanin, wird das Enzym inaktiviert. Die Modifikation des Substrats, so dass es das His in der richtigen Position liefert, wenn das Enzym das Substrat bindet, reaktiviert das Enzym, und es kommt zur Proteolyse
His-SK an P2 des Substrats kann die Imidazolgruppe der katalytischen Triade sterisch beinahe perfekt ersetzen-> Substrat N-succinyl-Phe-Ala-His-Phe-pNitrpnailid wird bei pH 8 um den Faktor 400 schneller Hydrolysiert als das Substrat mit P2 Ala oder P2 Gln. Strategie zum Engineering von Proteasen mit besonders enger Substratspezifität.
