Flisikowski
4 Enzymhauptgruppen zur DNA Modifikation nennen. Welche Funktion haben Sie und für welche Ansätze kann man Sie verwenden?
DNA Polymerase
- baut Einzelnukleotide komplementär zum Basisstrang ein und synthetisiert so einen neuen DNA Strang
DNA Ligase
- verknüpft längere DNA Fragmente, also verwendet nicht einzelnen Nukleotide wie die Polymerase
Endonuklease
- schneiden doppelsträngige DNA mittig (endogen in der DNA Struktur)
Exonukleasen
- Entfernt die terminalen Nukleotide der DNA
Wie viele Gene besitzt das gesamte humane Genom? Wie viel Prozent des Genoms sind codierend? Welcher Anteil der Gene befindet sich auf dem X Chromosom?
Das humane Genom besitzt in etwa 22.000 Gene. Diese Gene machen jedoch nur in etwa 2% der gesamten DNA aus. Auf dem X Chromosom befinden sich in etwas 10% der Gene. Es ist damit das größte menschliche Chromosom.
Was sind die strukturellen Elemente eines eukaryotischen Gens? Erklären Sie Branch Sites und die Kozak-Sequenz.
Strukturelle Elemente:
- Exons
- Introns inkl Branch Site
- Kozak Sequenz
- Start und Stopcodons
Das eigentliche Gen enthält sowohl Introns als auch Exons. Hierbei codieren nur die Exons für das spätere Protein, während die Introns herausgespliced werden. Jedes Intron beginnt mit einem GT und endet mit einem AG. Außerdem befindet sich im Intron die sog. Branch Site, welche vom Splicosom erkannt wird. Das Gen startet mit einem Startcodon (meist ATG) und endet mit einem Stopcodon (TAA, TAG, TGA). Damit auch das korrekte Startcodon vom Ribosom erkannt wird und nicht ein beliebiges ATG, gibt es die Kozak-Sequenz, in welcher sich das ATG/AUG befinden muss.
Welche Bestandteile hat ein Promotor?
- Core Promotor: Bindet den eigentlichen Transkriptionsapperat. 35 bp Upstream vom Transkriptionsstart.
- Proximaler Promotor: Beinhaltet regulatorische Elemente. 100 bp upstream vom Transkriptionsstart
- Distaler Promotor: Weitere regulatorische Element. Several 1000 bp upstream vom Transkriptionsstart.
Welchen Arten von Promotoren gibt es?
Konstitutive Promotoren
- Direkte Expression in fast allen Gewebarten
- Expression ist meisten unhabhängig von endogenen Faktoren
Gewebe spezifische Promotoren
- Operieren in spezifischem Gewebe und Entwicklungsstadien von Organismen
- Können von endogenen und exogenen Faktoren abhängen
Inuzierbare Promotoren
- Chemisch reguliert, durch chemische Komponenten des Organismus
- Physikalisch reguliert durch abiotische und externe Faktoren wie Licht, Temperatur oder mechanische Verletzungen
Synthetische Promotoren
- Existieren nicht in der Natur, sondern werden künstlich zur Genregulierung hergestellt.
Wie lässt sich die Promotoraktivität überprüfen?
Mit Hilfe eines Luciferase Assays. Hierbei wird das Luciferase Gen hinter den Promotor eingebaut. Ist der Promotor aktiv so wird das Luciferase Protein hergestellt, welches zu einem grünen Leuchten führt, welches nachgewiesen werde kann.
Nennen Sie 4 Arten der Modifikation im target Gene
Gen-Unterbrechung (gene disruption)
Gen-Modifizierung (gene modification)
Gen-Ersatz (gene replacement)
Modulation der Genaktivitaet
Was ist ein Transgen?
Ein weiteres eingeschleustes Gen einer anderen Art durch rekombinante DNA-Technik. Träger dieser Gene bezeichnet man als transgene Organismen.
Was sind die regulatorischn Elemente eine eukaryotischen Gens.
Regulatorische Elemente:
- Promotor
- 5' UTR und 3' UTR
- Silencer und Enhancer
Vor dem Startcodon befindet sich die 5' UTR und nach dem Stopcodon die 3' UTR. Vor der 5' UTR wiederum befindet sich der Promotor. Die Trankription beginnt an der 5' UTR. Hinzu gibt es noch sog. Silencer und Enhancer welche vor oder an den Promotor binden können und die negativ bzw. positiv Transkription beinflussen.
WAs sind ARE? Was versteht man unter ARE vermiteltem mRNA turnover?
ARE=AU-rich element
- cis-regulatorisches Element in der 3'UTR
- bestimmt mRNA Stability, durch trans-regulatorische Proteine die diese binden und sie dadurch stabilisieren oder destabilisieren
- 10% von Mammal mRNA enthalten AREs
Was ist das Splicosome? Was spielt eine wichtige Rolle bei der Erkennung von Introns?
Das Splicosome ist ein RNA Protein Komplex im Zellkern der das herausschneiden (splicing) der Introns katalysiert. Es besteht unter anderem aus snRNP ("snurps). Hierbei ist die Branch Site innerhalb des Introns zur Erkennung wichtig.
Was ist Nonsense-mediated mRNA decay (NMD)?
Ein Kontrollmechanismus in eukaryotischen Zellen, der vorzeitige Stopcodons in der mRNA erkennt und dadurch die Expression von zu kurzen Proteinen verhindert.
Nach dem Splicing befinden sich die Exon Junctions (Proteinkomplexe) an den Exongrenzen. Diese werden durch die Translation vom Ribosom entfernt. Sind nach der Translation noch Exon Junxtion, weil ein vorzeitiges Stopcodon existiert so wird der NMD aktiv, welcher die mRNA abbaut. NMD greift nicht wenn vorzeitiges Stopcodon sich im lezten Exon befindet oder wenn keine Introns existieren.
Es gibt ca. 20000 Gene im menschlichen Genom. Dennoch gibt es mehr als 1 Millionen Proteine im Proteom. Wie kommt es dazu?
Es gibt mehrere Gründe
- alternative Promotoren
- alternatives Splicing
- mRNA Editierung und posttranslationale Modifikationen
Welche Bereiche des Gens kann man bei einem Gene knockout modifizieren?
Man kann entweder das komplette Gen entfernen oder die Kozak Sequenz deletieren/modifiziern. Nur den Promotor zu modifizeiren reicht nicht aus, da immernoch schwache Genexpression vorkommen kann.
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Flashcards
4 Enzymhauptgruppen zur DNA Modifikation nennen. Welche Funktion haben Sie und für welche Ansätze kann man Sie verwenden?
DNA Polymerase
- baut Einzelnukleotide komplementär zum Basisstrang ein und synthetisiert so einen neuen DNA Strang
DNA Ligase
- verknüpft längere DNA Fragmente, also verwendet nicht einzelnen Nukleotide wie die Polymerase
Endonuklease
- schneiden doppelsträngige DNA mittig (endogen in der DNA Struktur)
Exonukleasen
- Entfernt die terminalen Nukleotide der DNA
Wie viele Gene besitzt das gesamte humane Genom? Wie viel Prozent des Genoms sind codierend? Welcher Anteil der Gene befindet sich auf dem X Chromosom?
Das humane Genom besitzt in etwa 22.000 Gene. Diese Gene machen jedoch nur in etwa 2% der gesamten DNA aus. Auf dem X Chromosom befinden sich in etwas 10% der Gene. Es ist damit das größte menschliche Chromosom.
Was sind die strukturellen Elemente eines eukaryotischen Gens? Erklären Sie Branch Sites und die Kozak-Sequenz.
Strukturelle Elemente:
- Exons
- Introns inkl Branch Site
- Kozak Sequenz
- Start und Stopcodons
Das eigentliche Gen enthält sowohl Introns als auch Exons. Hierbei codieren nur die Exons für das spätere Protein, während die Introns herausgespliced werden. Jedes Intron beginnt mit einem GT und endet mit einem AG. Außerdem befindet sich im Intron die sog. Branch Site, welche vom Splicosom erkannt wird. Das Gen startet mit einem Startcodon (meist ATG) und endet mit einem Stopcodon (TAA, TAG, TGA). Damit auch das korrekte Startcodon vom Ribosom erkannt wird und nicht ein beliebiges ATG, gibt es die Kozak-Sequenz, in welcher sich das ATG/AUG befinden muss.
Welche Bestandteile hat ein Promotor?
- Core Promotor: Bindet den eigentlichen Transkriptionsapperat. 35 bp Upstream vom Transkriptionsstart.
- Proximaler Promotor: Beinhaltet regulatorische Elemente. 100 bp upstream vom Transkriptionsstart
- Distaler Promotor: Weitere regulatorische Element. Several 1000 bp upstream vom Transkriptionsstart.
Welchen Arten von Promotoren gibt es?
Konstitutive Promotoren
- Direkte Expression in fast allen Gewebarten
- Expression ist meisten unhabhängig von endogenen Faktoren
Gewebe spezifische Promotoren
- Operieren in spezifischem Gewebe und Entwicklungsstadien von Organismen
- Können von endogenen und exogenen Faktoren abhängen
Inuzierbare Promotoren
- Chemisch reguliert, durch chemische Komponenten des Organismus
- Physikalisch reguliert durch abiotische und externe Faktoren wie Licht, Temperatur oder mechanische Verletzungen
Synthetische Promotoren
- Existieren nicht in der Natur, sondern werden künstlich zur Genregulierung hergestellt.
Wie lässt sich die Promotoraktivität überprüfen?
Mit Hilfe eines Luciferase Assays. Hierbei wird das Luciferase Gen hinter den Promotor eingebaut. Ist der Promotor aktiv so wird das Luciferase Protein hergestellt, welches zu einem grünen Leuchten führt, welches nachgewiesen werde kann.
Nennen Sie 4 Arten der Modifikation im target Gene
Gen-Unterbrechung (gene disruption)
Gen-Modifizierung (gene modification)
Gen-Ersatz (gene replacement)
Modulation der Genaktivitaet
Was ist ein Transgen?
Ein weiteres eingeschleustes Gen einer anderen Art durch rekombinante DNA-Technik. Träger dieser Gene bezeichnet man als transgene Organismen.
Was sind die regulatorischn Elemente eine eukaryotischen Gens.
Regulatorische Elemente:
- Promotor
- 5' UTR und 3' UTR
- Silencer und Enhancer
Vor dem Startcodon befindet sich die 5' UTR und nach dem Stopcodon die 3' UTR. Vor der 5' UTR wiederum befindet sich der Promotor. Die Trankription beginnt an der 5' UTR. Hinzu gibt es noch sog. Silencer und Enhancer welche vor oder an den Promotor binden können und die negativ bzw. positiv Transkription beinflussen.
WAs sind ARE? Was versteht man unter ARE vermiteltem mRNA turnover?
ARE=AU-rich element
- cis-regulatorisches Element in der 3'UTR
- bestimmt mRNA Stability, durch trans-regulatorische Proteine die diese binden und sie dadurch stabilisieren oder destabilisieren
- 10% von Mammal mRNA enthalten AREs
Was ist das Splicosome? Was spielt eine wichtige Rolle bei der Erkennung von Introns?
Das Splicosome ist ein RNA Protein Komplex im Zellkern der das herausschneiden (splicing) der Introns katalysiert. Es besteht unter anderem aus snRNP ("snurps). Hierbei ist die Branch Site innerhalb des Introns zur Erkennung wichtig.
Was ist Nonsense-mediated mRNA decay (NMD)?
Ein Kontrollmechanismus in eukaryotischen Zellen, der vorzeitige Stopcodons in der mRNA erkennt und dadurch die Expression von zu kurzen Proteinen verhindert.
Nach dem Splicing befinden sich die Exon Junctions (Proteinkomplexe) an den Exongrenzen. Diese werden durch die Translation vom Ribosom entfernt. Sind nach der Translation noch Exon Junxtion, weil ein vorzeitiges Stopcodon existiert so wird der NMD aktiv, welcher die mRNA abbaut. NMD greift nicht wenn vorzeitiges Stopcodon sich im lezten Exon befindet oder wenn keine Introns existieren.
Es gibt ca. 20000 Gene im menschlichen Genom. Dennoch gibt es mehr als 1 Millionen Proteine im Proteom. Wie kommt es dazu?
Es gibt mehrere Gründe
- alternative Promotoren
- alternatives Splicing
- mRNA Editierung und posttranslationale Modifikationen
Welche Bereiche des Gens kann man bei einem Gene knockout modifizieren?
Man kann entweder das komplette Gen entfernen oder die Kozak Sequenz deletieren/modifiziern. Nur den Promotor zu modifizeiren reicht nicht aus, da immernoch schwache Genexpression vorkommen kann.
