Mikrobiologie 2. Semester - ZHAW

Pilze sind Ubiquitär. Die meisten sind aerob, es gibt aber auch einzelne fakultativ anaerobe Pilze.

Neue Erkenntnisse aus der Molekularbiologie haben zu einer neuen Einteilung der Pilze geführt. Es wird unterschieden zwischen echten Pilzen und Protisten (pilzähnliche Formen).

Es werden Sporen gebildet. Dabei wird zwischen sexuelle und asexuellen Sporen unterschieden. Für die Verbreitung spielen die asexuelle Sporen die Hauptrolle. Asexuelle durchlaufen eine Mitose oder werden abgeschnürt, bevor sie ohne Verschmelzung wachsen. Sexuelle Sporen werden durch Meiose gebildet.

Bei Wachstum bildet sich aus den Hyphen ein Mycel. Das Mycel beschreibt die Gesamtheit der Hyphen und bildet den Körper des Pilzes.

Hyphen wachsen hauptsächlich in der Zone unmittelbar hinder der Spitze (Mitose). Hyphen können autonom weiter wachsen, wenn sie getrennt werden.

• telemorphe Arte vermehren sich sexuell 
• Anamorphe Aren hingegen vermehren sich auschliesslich asexuell

Die asexuelle Fruchtifikation beschreibt die Fruchtkörperbildung von Pilzen, die sich nicht sexuell vermehren. Diese Art von Pilzen wird auch als die anamorphe Form bezeichnet. Es gibt verschiedene Arten von Sporen.

• Konidiosporen
  • einzeln oder verkettet und auf Konidienträgern insertiert, Konidienträger sind sehr formenreich
• Sporangiosporen
  • Entwicklung der Sporen in Sporenbehältern, den Sporangien, vorkommend bei den Zygomyceten
• Zoosporen
  • begeisselte Sporen, können sich im Wasser/Wasserfilm fortbewegen, können auf asexuellem oder sexuellem Weg entstehen
• Arthrosporen
  • enstehen durch zerbrechen von Hyphen
• Chlamydosporen
  • Entstehen innerhalb von Hyphen und auch durch Sprossung, sind von einer dicken Wand umgeben

Sie beschreibt die Fruchtkörperbildung von teleomorphen Pilzen (sich sexuell vermehrenden Pilzen). Es werden dabei durch Meiose Sporen gebildet, die anschliessend Verschmelzen. Sexuell gebildete Sporen bilden oft die Überdauerungsform von Pilzen.

1. Plasmogamie: Verschmelzung der Protoplasten (kleinste selbständig lebensfähige morphologische Einheit bzw. das Plasma) zweier Pilzhyphen
2. Karyogamie: Verschmelzung beider haploider Zellkerne
3. Zygotenbildung: Plasmo- und Karyogamie ergibt eine diploide Zelle.
4. Meiose: Rekombination und Bildung haplioder Kerne

• Zygosporen (Zygomycota)
• Ascosporen (Ascomycota)

Gametangiogamie :

• Verschmelzung zweier Gametangien zu Beginn der sexuellen Fruktifikation

  • Gametangien sind Behälter, in denen die Gameten gebildet werden

Gametogamie:

• Verschmelzung zweier Gameten (Keimzellen, meiosisch erzeugte Zellen) zu Beginn der sexuellen Fruktifikation

• Namensgebung durch die Bildungsart der Sporen (Zygosporen)
• schnell wachsend, bilden septierte Hyphen
• Verderb bei Obst, Brot, Starterkulturen bei asiatischen Produkten
• mesophil, einige psychrophil
• Bildung von Sporangiensporen (asexuelle Fruchtifikationsorgane)

Beim Auskeimen der Sporen bildet sich zunächst ein Luftmycel, das sich in eine Rhizoide ("Wurzel") umwandelt, wenn es auf Substrat trifft. Über den Rhizoiden bilden sich Sporangienträger. Diese sind teilweise von Querwänden unterteilt. Sie setzten bei Berührung Sporen frei. In den Hyphen kommt es zudem zu Chlamydosporen, die nach freiwerden ebenfalls neue Pilzthalli bilden können.

• zwei kompatible Mycelien treffen aufeinander. Es bilden sich Zygophoren, die sich mit Cytoplasma und Kernen anreichern und sich mit einer Querwand von der Trägerhyphe abtrennen.
• Diese sogenannten Gametangien verschmelzen (Gametangiogamie)
• Das Zygosporangium vegrössert sich und es reift eine Dauerspore heran. Einige Kerne verschmelzen nach einer gewissen Zeit.
• Ein einzelner diploider Kern bringt durch Meiose vier Tochterzellen hervor, wovon eine ein Sporangium bildet.
• Die Sporangiensporen sind alle genetisch gleich. 

• Art von Pilze (Schlauchpilze)
• Umfasst die Hälfte der bekannten Pilze
• vielfältige morphologische und physiologische Eigenheiten
• Hyphen sind septiert (ausser Hefen)

Ein Ascus ist das Organ, in dem die sexuellen Fruchtifikationsformen gebildet werden.

Beginnt mit der Keimung der Spore zur Keimhyphe, die sich zu einem vielverzwigten, mehrzelligen, septierten Mycel entwickelt.

Es entwickeln sich zunächst Konidienträger. An diesen entstehen Sterigmen, auf denen perlschnurartig die Konidien angeordnet sind. Es gibt viele Konidien pro Mycel. Die Sporen sind asexuell, können also ohne Befruchtung eine Hyphe bilden.

• Fortpflanzung durch Sprossung
• Tochterzelle stülpt sich aus der Mutterzelle heraus und nimmt dabei einen Teil der Kernsubstanz mit
• Entweder abgeschnürt oder Zellverband
• Die Zellverbände werden Pseudomycel oder Sprossmycel genannt

Keime in Nase

• In Papiertaschentuch durch die Nase ausatmen, dabei die Luft durch den Mund holen, auch später.
• Hals-Nasen-Ohren Arzt aufsuchen

Keime in Auge

• Auge nicht reiben
• Auge von der Nasenwurzen her nach aussen ausgiebig unter fliessendem Wasser (oder Augendusche) mit weichem Strahl spülen
• Augen dabei weit spreizen und nach allen Seiten bewegen lassen
• Augenarzt aufsuchen

Keime in Hautwunde

• Wunde ausbluten lassen, schlecht blutende Wunden mit Vakuumpumpe aussaugen
• Wunde mit Keimfreiem Verband abdecken
• Arzt aufsuchen

Reinigung:

• Sammelbegriff für das Aufrechterhalten und Wiederherstellen von Reinheit

Desinfektion:

• Reduktion von pathogenen Mikroorganismen durch mechanische oder chemische Verfahren
• Desinfektion mit Alkoholen, Halogenen, Peroxiden oder Ozon
• Wirksamkeit der Desinfektionsmittel wird von Reinigungsmitteln (verschiebung des pH) oder durch tiefe Temperaturen herabgesetzt

Sterilisation:

• Abtötung alles MO einschliesslich deren Sporen zur Keimfreiheit
• Sterilisation mit feuchter Hitze: 121 °C während 15 - 20 Minuten mit Sattdampf, oft für Nährmedien und wässrige Lösungen
• Sterilisation mit trockener Hitze: längere Einwirkungszeiten als mit feuchter Hitze, meist für Gefässe oder Gerätschaften
• Einwirkugnszeit von etwa 2 Stunden bei 160 bis 180 °C
• Chemische Sterilisation: mit mirkobioziden Gasen, Natronlauge, Wasserstoffperoxid oder Ozon

konventionelle Steriltests:

• Sterilisierte Gegenstände werden nach der Sterilisation mittels kulturellen Nachweismethoden auf die sterilität überprüft
• eventuell werden nicht alle Keime erfasst

Steriltest mit Bioindikatoren

• Einsatz eines thermoresistenten Keims, auf den das Sterilisiergut nach der Sterilisation untersucht wird

Steriltest mit Farbumschlag

• Klebebänder verändern mit ausreichender Hitzeeinwirkung die Farbe
• Geben jedoch nur an, dass die Temperatur erreicht worden ist und nicht, ob alle Keime effektiv abgetötet wurden

• Arbeiten mit MO soll in einem keimarmen Labor oder einer Impfkabine erfolgen
• Zugluft im Labor ist zu vermeiden, regelmässige Desinfektion von Oberflächen und der Luft (UV-Bestrahlung)
• Ränder von Glasgefässen müssen vor- und nach Gebrauch abflammen (mit Ausnahme von Flaschen mit Plastikdichtung)
• Gefässe nur so lange geöffnet lassen wie nötig
• Stopfen und andere Geräte, die noch gebraucht werden nie auf den Tisch ablegen

• Konsistenz
• Zusammensetzung
• Verwendungszweck

• flüssig/fest
• flüssige Nährmedien sind z. T. komplexe Medien (enthalten organische Bestandteile, Zusammensetzung ist meistens nicht genau bekannt),
  • Sie werden für die Anreicherung von Bakterien, die Überprüfung von Reinkulturen oder die Gewinnung grösserer Zellmengen benutzt
• feste Nährmedien werden für die Keimzahlbestimmung oder die Gewinnung, Überprüfung oder Aufbewahrung von Reinkulturen benutzt
  • flüssige Nährmedien werden mit Agarbeigabe oder Gelatine in feste Form gebracht

• feste Nährmedien werden für die Keimzahlbestimmung oder die Gewinnung, Überprüfung oder Aufbewahrung von Reinkulturen benutzt
• flüssige Nährmedien werden mit Agarbeigabe oder Gelatine in feste Form gebracht

• synthetische Medien enthalten aussschliesslich chemisch exakt definierte Bestandteile in bekannter Konzentration (z.B. Zucker, Alkohole, Fettsäuren und Stickstoffquellen)
• Komplexmedien enthalten ein oder mehrere organische Bestandteile, deren chemische Zusammensetzung nicht genau bekannt ist
• Minimalmedien enthalten die unbedingt notwendigen Stoffe, Vollmedien enthalten dagegen noch weitere Verbindungen, die jedoch nicht überlebensnotwendig sind, das Wachstum aber fördern. Ein komplexes Medium ist immer ein Vollmedium

• Es wird zwischen Universalnährmedien, Selektivnährmedien und Differenzialnährmedien unterschieden
• Universalmedien sind Komplexmedien, die für eine Vielzahl von MO geeignet sind
• Selektivnährmedien werden für die weitgehende Isolierung von bestimmten MO oder MO-Gattungen eingesetzt. Es gibt flüssige und feste Selektivnährmedien (für Anreicherung oder Isolierung)
• Differenzialnährmedien reagieren mit Stoffwechselprodukten und verändern dadurch ihre Farbe

Für die Anzucht von Bakterien können viele verschiedene Nährmedien eingesetzt werden:

• Bouillonkultur
• Plattenausstrich
• Gusskultur
• Schüttelkultur
• Agarschrägkultur

Die verschiedenen Bebrühtungsarten haben dabei unterschiedliche Ziele. Die Bebrühtung erfolgt in einem Brutschrank, in welchem Temperatur, Zeit und eventuell Sauerstoffverhältnisse angepasst werden können. Platten werden meistens mit dem Deckel nach unten bebrühtet.

Es gibt verschiedene Aufbewahrungsmethoden für Bakterien. Man unterscheidet dabei zwischen Referenzstämmen (Mo mit ganz bestimmten Eigenschaften wie z.B. Candida albicans), Stammkulturen (Subkultur eines Referenzstammes) und Gebrauchskulturen (Subkulturen von Stammkulturen)

Die Referenzstämme können u.a aus folgenden Stammsammlungen bezogen werden

• ATCC: American Type Culture Collection
• DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
• CBS: Centralbureau voor Schimmelcultures

Dort werden die MO entweder Trockenkonserviert (Gefriertrocknung, auf Silikagel oder Gelatineblättchen) oder Gefrierkonvserviert (Stickstoff oder Glasperlen bei -70 °C). Die MO überleben dabei zwischen 10 und 30 Jahren.

Für kurzfristigere Aufbewahrung eignen sich auch Schrägagarkulturen, Agarstrichkulturen oder die Konservierung unter Paraffinöl.

Beim Revitalisieren werden die konservierten MO (in Röhrchen oder Öse) mit BHI-Bouillon versetzt und in ein Reagenzglas gebracht. Die enthaltenen Nährstoffe reichen ca. 24h aus. Nach diesen 24h sind alle Nährstoffe verbraucht und die MO sterben ab. Deswegen werden sie spätestens während der stationären Phase weiterverarbeitet (am besten während der Log-Phase). 

Mit dem Drei-Ösen-Ausstrich mit einem selektiven Nährmedium, das den gewünschten Keim hemmt, kann die Reinheit der Probe überprüft werden.

• Flüssig-Flüssig mit einer Öse
  • Mit der Öse in die Kulturlösung tauchen, wobei darauf zu achten ist, dass die Impföse nicht an der Öffnung oder Aussenwand des Reagenzglases anstosst. Eine Flüssigkeitshaut muss in der Öse ausgespannt sein.
  • Einbringen des Impfgutes in die sterile Nährlösung:  
  • Die Impföse in die Nährlösung einführen und leicht schwenken.  
• Fest-Flüssig mit einer Öse
  • Wie oben, mit der Öse werden auf dem festen Nährmedium Mo aufgenommen, die anschliessend in die Nährlösung gegeben werden
• Flüssig-Fest mit einer Öse
  • Gussplattenverfahren oder Oberflächenausstrichverfahren
• Fest-Fest mit einer Öse
  • Entname mit der Öse, Ausstrich auf einem einem Schrägagarröhrchen (Schlangenlinie)

Gesamtzellzahl berücksichtigt alle (lebende und tote) Zellen. Sie wird Mikroskopisch oder mit optischer Dichte bestimmt.

Die Lebendzellzahl wird mit Kultivierungsverfahren bestimmt. Sie erfasst alle lebenden Zellen.

Die dezimale Verdünnungsreihe wird angelegt, um eine Konzentration zu erhalten, die kulturell bestimmt (bzw. ausgezählt) werden kann, bzw. eine Konzentration mit der die gewünschten Methoden sinnvoll durchgeführt werden können.

Vorgehen: Von der Stammlösung wird (nach Vortexen) ein Milliliter in ein Ragenzglas mit steriler Verdünnungslösung gegeben. Von dieser Verdünnung ausgehend wird wieder ein Milliliter in ein weiteres Reagenzglas gegeben usw. Die Verdünnungen weren der Reihe nach mit -1, -2 etc. angeschrieben.