Praktikum BVT

⇒ einfachste Art der Kultivierung im Labormaßstab ⇒ mit einem Antrieb bis zu mehrere 100 Reaktionsgefäße in einem Inkubator parallel betrieben 

Stoffaustausch zw. Gasphase im Inkubator und Flüssigphase im Schüttelkolben ist beeinflusst durch:

• Kolbengeometrie (mit/ohne Schikanen, Durchmesser des Kolbenbodens D)
• Füllvolumen V_F
• Betriebsbedingungen (Drehzahl n, Extrenzität e_D) 
• Eigenschaften der Flüssigkeit (Viskosität v, Diffusionskoeffizient in der Flüssigkeit D_{O2, F}, Benetzungsverhalten) 
• Stofftransporteigenschaften des Sterilfilters (Stopfen/Metallkappe)

Oxygen transmission rate (OTR) is the measurement of the amount of oxygen gas that passes through a substance over a given period. It is mostly carried out on non-porous materials, where the mode of transport is diffusion, but there are a growing number of applications where the transmission rate also depends on flow through apertures of some description.

• Kolbengeometrie & Füllvolumen: 

Sauerstoff ist lediglich im Kopfraum des Schüttelkolbens oder zu Beginn als gelöstes Gas im Reaktionsmedium VL vorhanden. 

Eine Zunahme des spezifischen Leistungseintrags kann durch:

• Erhöhung der Schüttelfrequenz n
• Reduzierung des Füllvolumens VL
• Vergrößerung des Schüttelkolbendurchmessers d 
• Erhöhung der Viskosität η 

erreicht werden. 

• Schüttelkolben mit Schikanen werden häufig verwendet, um die Durchmischung zu verbessern sowie den Sauerstoffeintrag in die Kulturbrühe im Vergleich zu Standardkolben (bei gleicher Schüttelfrequenz) zu erhöhen.

• Biotechnologisches Produkt nach der Reaktion ⇒ komplexes Gemisch

Prozessschema zur biotech. Produktisolierung:

1. Zellabtrennung (Zentrifugalseparatoren, Querstromfiltration)
2. Zellaufschluss (mechanisch, enzymatisch, chemisch)
3. Proteinabtrennung (Hitzedenaturierung, Proteinfällung, Proteinextraktion)
4. Entsalzung, Aufkonzentrierung (Diafiltration, Ultrafiltration)
5. Feinreinigung (Chromatographie)
6. Formulierung (Gefriertrocknung, Sprühtrockung) 

⇒ um intrazelluläre Proteine freizusetzen

Schwingmühle: 

• Reaktionsraum biz zu 60% mit Glaskugeln befüllt ⇒ Schwingen der Reaktionsgefäße ⇒ Zellen mechanisch zerstört
• Freisetzung intrazellulärer Enzyme nach Geschw.gesetz 1.Ordnung: 

\(ln {C_{m} \over C_{m} - C(t) } = k \cdot t\)

c_m ... maximaler Enzymmenge

k... Reaktionsgeschwindigkeitskonstante [s^-1]

c(t) ... freigesetzte Enzymmenge zum Zeitpunkt t

⇒ selektive Herauslösen eines Wertstoffes aus einem Flüssigkeitsgemisch mit einem Lösungsmittel, welche nicht oder nur teilweise mit der Flüssigkeit mischbar ist

• Flüssigkeit wird intensiv mit dem LM in Kontakt gebracht (mixer)
• Wertstoff aus Flüssigkeitsgemisch (Abgeber- od. Raffinatphase; Salze/Wasser/Zellaufschluss + Wertstoff) ⇒ in das LM (Aufnehmer- oder Extraktphase; Wertstoff + Polyethylenglykol/Wasser) 
• Nach Austausch müssen beide Phasen im Schwerkraft- oder Zentrifugalfeld wieder getrennt werden (settler) ⇒ Deswegen sollen die Dichten der beiden Phasen verschieden sein! 

Nach Nernst'schen Verteilungssatz gilt für verdünnte Lösungen: 

\(K = {c_{E(Oberphase)} \over c_{R(Unterphase)}}\)

Bei konstantem Druck und Temperatur steht das Verhältnis der Wertstoffkonz. in beiden Phasen in einem festen Verhältnis. 

⇒ So muss Löslichkeitsverhalten aller 3 Komponenten betrachtet werden (Abgeber, LM, Wertstoff)

⇒ Darstellung im Dreiecksdiagramm für konstanten Druck und konstante T 

• über 3 Dreieckskanten werden die steigenden Konzentrationen aller 3 Komponenten aufgetragen
• Skala ist als Parallelschar an der linken Seite des Dreiecks orientiert ⇒ auf allen parallel zur linken Dreiecksseite verlaufenden Linien im Diagram befinden sich Mischungspunkte M, die eine gleiche PEG-Konzentration besitzen
• für die zwei weitere Achsen gilten analoge Regeln
• Binodalkurven (empirisch durch Mischexperimente bestimmt) trennen das Dreieicksdiagramm in eine Zone, in der die beiden LM-Phasen frei ineinander mischbar sind, und in einen Bereich unterhalb der Binodalkurve, in der eine Mischung in zwei Phasen zerfällt
• Mischungspunkt M befindet sich im nicht mischbaren Bereich und zerfällt unter der Konnode (Verbindungsgerade zw.  Extrakt E und Raffinat R; empirisch bestimmt) in 2 Phasen (Punkte E und R)
• Zusammensetzungen der E und R-Phase können im Diagramm abgelesen werden
• Mengenverhältnis der E und R ist gleich dem Verhältnis der Strecken EM zur RM 

Als Maß für die Enzymaktivität dient die Einheit Unit (U), die wie folgt definiert ist: 

Ein Unit entspricht derjenigen Enzymmenge, welche die Umsetzung von 1 µmol Substrat pro Minute unter genau festgelegten Bedingungen katalysiert. 

⇒ Quantifizierung der Substratumsetzung über die Änderung der Lichtabsorption 

• ß-Galactosidase spaltet in einer Lösung des farblosen künstlichen Substrats ONPG das gelbgefärbte o-Nitrophenol ab, dessen zeitabhängige Bildung bei 436 nm bestimmt werden kann
• Die Enzymaktivität wird aus der gemessenen Absorptionsänderung \(\triangle E\) im Intervall \(\triangle t\) ermittelt, idem die Absorption gegen die Zeit aufgetragen und die Steigung aus linearen Bereich der Kurve ermittelt wird

Diie Betriebsparameter müssen (z. B. Schüttelfrequenz, Füllvolumen, Schütteldurchmesser) so gewählt werden, dass die Kultivierung unter optimalen Bedingungen abläuft. 

Genügend Substrat- und Sauerstoffkonzentration muss vorhanden sein.

Sauerstoffeintrag ins Reaktionsmedium stellt bei aeroben Prozessen häufig den limitierenden Faktor dar, da O2 in wässrigen Lösungen nur relativ gering löslich ist. 

OUR = \({dc_{o} \over dt}\)

⇒ Abfall der Sauerstoffkonzentration im Reaktor

Ertragskoeffizient ist gebildete Zellmasse / umgesetztes Substrat. 

\(Y_{XS,µ} \equiv {dc_{x} \over dc_{s}}\)und dc_x = 15 gL^-1, dc_s = 30 gL^_-1

_{^{⇒ Y}XS, µ} = 1/2 

-

O2-Partialdruck kann währen der mikrobiollen Reaktion sowohl durch die Rührgeschwindigkeit (Leistungseintrag) als auch durch die Begasungsrate beeinflusst werden. 

?

Massenzunahme von MO

Zunahme der Zellzahl von MO

\(c_{N} = c_{0} \cdot 2^{n}\)

\(c_{0}\)... Startzellzahl

\(µ = {1 \over c_{x}} \cdot {dc_{x} \over dt}\)

\(c_{x}\)... aktuelle Zellkonzentration

• Adaptations- oder lag-Phase

tritt nach dem Animpfen

keine Zunahme der Biomassekonzentration

Stoffwechsel der Zellen passt sich an die neuen Reaktionsbedingungen an

• Übergangsphase

Wachstum setzt allmählich ein

• exponentielle Wachstumsphase

exponentielle Zunahme der Zellmasse

für Wachstum nötige Komponenten sind im Überschuss 

• Subtratlimitierungsphase 

Wachstum durch Verbrauch der Substrate begrenzt

Wachstumsgeschw. nimmt ab

• stationäre Phase

Maximum der Biomassekonzentration erreicht 

fehlende Substrate => kein Wachstum mehr

dynamisches GGW zw. Wachstum und Absterben

Speicherstoffe lebender Zellen oder bei dem Zelltod freigesetzte Substanzen werden umgesetzt

• Absterbephase

\(µ = µ_{max} \cdot {c_{s}\over K_{s} + c_{s}}\)

\(c_{s}\)... Substratkonzentration 

\(K_{s}\)... Sättigungskonzentration (Substratkonzentration, bei der die spezifische Wachstumsrate die Hälfte des max. Wertes erreicht hat) 

⇒ Wachstumsrate hängt somit von der limitierenden Substratkonzentration ab.

\(q_{s} \equiv {1 \over c_{x}} \cdot {dc_{s} \over dt}\)

Die spezifische Substrataufnahmerate (SAR) setzt sich aus: 

• SAR für Zellwachstum
• SAR für den Erhaltungsstoffwechsel
• SAR für Produktbildung

\(q_{s} = q_{s,µ} + q_{s,m} + q_{s, p}\)

\(q_{p} \equiv {1 \over c_{x}} \cdot {dc_{p} \over dt}\)

• ist eine Funktion der spezifischen Wachstumsrate µ
• Substrataufnahme und Wachstum werden über Ertragskoeffizienten \(Y_{XS}\) miteinander verknüpft
• \(Y_{XS}\) ist gebildete Zellmasse / umgesetztes Substrat

\(q_{s,µ} = {µ \over Y_{XS, µ}}\) und \(Y_{XS,µ} \equiv {dc_{x} \over dc_{s}}\)

\({dc_{i} \over dt} = r_{i} \cdot c{x}\)

\(r_{i}\)... spezifische Reaktionsgeschwindigkeit der Komponente i

\(c_{x}\)... Zellkonzentration

Isotrop bedeutet, dass die Konzentrationen aller Reaktionskomponenten, die physikalischen Eigeschaften der Reaktionsmischung und die Reaktionsgeschwindigkeiten räumlich konstant sind. 

ideale Rührkesselreaktoren ⇒ isotrop

Zellen: \({dc_{x} \over dt} = µ \cdot c_{x}\)

Substrat: \({dc_{s} \over dt} = - ( {µ \over Y_{XS,u}} + m_{s})\cdot c_{x}\)

Sie kommen zur Anwendung, wenn die Substratkonzentration die Produktivität und die Ausbeute beeinflusst.

Vorteile:

• Mit ein Zulaufverfahren kann eine Katabolit-Repression umgegangen werden.
• Möglichkeit zur Einstellung einer optimalen Wachstumsrate 
• Verlängerung der maximalen Prozesszeit