Zellkulturtechnologie

• LDH befindet sich normalerweise im Cytoplasma, bei Membranschädigung befindet sich LDH im Kulturüberstand 
• Oxidation/Umwandlung von Lactat zu Pyruvat unter Reduktion von NAD+ zur NADH durch LDH
• Wasserstoff von NADH wird dabei genutzt, um ein chromogene Substanz umzusetzen
• Die Zellschädigung kann man nach der Expositionsphase durch Prüfsubstanz verfassen => z.B. Fluoreszenz 
• nicht-destruktiv, da es eine Messung des Kulturüberstandes stattfindet 

Metabolische Aktivität ist nicht immer identisch mit Vitalität => Verifizierung erforderlich, z.B. Kontrolle im Mikroskop

Es kann z.B. sein, dass die Zellen nicht lethal geschädigt werden, aber bei metabolischen Read-out eine andere Veränderung sichtbar wird, z.B. die Atmungsaktivität der Zellen ist reduziert, sie sterben aber nicht ab. 

Fluoreszenztest: z.B. Calcein-AM

• nicht toxisch
• membrangänglich 

=> Hydrolysierung der membrangängige Komponente durch aktive enzymatische Aktivität (Acetylesterasen), die in der lebenden Zellen vorherrscht, in den toten Zellen aber nicht. Damit wird unterschieden, ob Zellen vital sind oder nicht. 

• Die vitale Zelle fluoresziert in Folge der Hydrolysierung 
• Gegenfärbung der toten Zellen mit nicht membrangängige Fluoreszenzstoffe

z.B. mit Propidium-Iodid => kann nur durch parforierten (toten) Zellen hindurchdiffundieren => lagert sich an DNA und fluoresziert rot. 

MTT-Test: 

Tetrazoliumsalzen + Dehydrogenasen (in aktiven Mitochondrien oder Cytosol der vitalen Zellen) => Formazane, die unterschiedliche Farben haben können (je nach Struktur). 

• Zellzahl einstellen (z.B. 2 verschiedene Zelltypen)
• 1 Tag Vorkultur (Zellen wachsen, adhärieren) 
• 24-36 h Inkubation mit Prüfsubstanzen + ansteigender Konzentration von links nach rechts + Blank (keine Zellen) + Kontrolle (nur organisches Lösungsmittel, die zur Lösung der Substanz benutzt wurde)
• Erholungsphase (optional)
• Zugabe von MTT, 2-3 h
• Zellaufschluss mit SDS/DMSO => Lysat 
• Photometrische Quantifizierung => Wenn viel abgestorbene Zellen vorhanden waren, wurden entsprechend viel weniger MTT umgesetzt.
• Wendepunkt der Kurve (IC50; solideste/stabilste Punkt der Kurve) => spricht für unterschiedliche Konzentration bei verschiedene Zellen => Vergleichen von zwei verschiedene Zellen 

Aufnahme von Neutroalrot: 

• ungeladen, farblos, membrangänglich 

Neutralrot wird in die vitale Zellen aufgenommen und wenn diese Farbstoff in Lysosomen gerät (pH 5), wird sie ionisiert (nicht mehr membrangängig) und bleibt in Lysosom (Ionenfalle). Zellen kann man mikroskopieren oder Farbstoff extrahieren und photometrisch messen. Wenn die Zellen rot sind, dann sind sie vital.

=> Bestimmung der Anzahl sich aktiv teilender Zellen in einer Kultur oder einem Gewebe 

• Immunologische Proliferationstest
• Proteingehalt
• DNA-Synthese 
• Analyse der Zellzyklusphasen

Antikörper gegen Proteine des Zellzyklus, z.B.

• Cycline 

Konzentration von Cyline hängt von den bestimmten Phase des Zellzyklus 

=> nicht immer vorhanden

• Ki67

Diese ist assoziiert mit allen Phasen von Zellzyklus und wenn sich die Zelle nicht mehr in Zellzyklus befindet, dann geht die Konzentration von Ki67 auch runter. 

• PCNA

Die Konzentration von diesen Indikatoren für die Zellzyklus z.B. über ELISA verfasst werden.

=> Messung des Proteingehalts in der Zelle

• Zunahme der Proteingehalt als Indiz für Proliferation
• Bradford-Assay 

Zellzahl einstellen => Prüfsubstanz applizieren/inkubieren => Zellaufschluss mit SDS => Kalibrationskurve mit Proteinstandard 

• Wachstumsinhibition > 30% => toxisch 

=> verfassen die Zunahme der DNA-Menge

Radioaktiv markiertes Thymidin bzw. Uridin wird zugegeben

• Diese Markern bauen sich bei der Replikation in DNA ein
• Zellen werden nach einem Tag werden mit NaOH lysiert
• Quantifizierung der DNA-Menge, die repliziert wurde, im Scintillationszähler

Nicht-radioaktiv: Bromdesoxyuridin BrdU

• kompetiert mit Thymidin bei der Einbau
• Immunchemische Markierung von Bromdesoxyuridin => Nachweis der Integration

Enzym markierte Antikörper gegen Bromdesoxyuridin => Enzym setzt die TMB um => Je mehr von diesen TMB umgesetzt wird, umso mehr wurden die Zellen repliziert => höhere/stärkere Proliferation 

=> Wie viele Zellen befinden sich in unterschiedlichen Zellzyklusphasen?

=> mittels FACS-Gerät 

• Kontrolle (links) & behandelte Probe (rechts)
• 2 Signale, die gemessen wird: DNA-Gehalt mittels DAPI & fluoreszenzmarkierte Bromdesoxyuridin 

=> Subpopulationen (Zellen, die in der verschiedene Phasen der Zellzyklus sich befinden) zuordnen

Es gibt viel mehr Zellen in der G2-Phase bei der Probe als bei der Kontrolle => Zellen bleiben bei der Probe in der G2-Phase aufgrund der behandelten Wirkstoff stecken. 

Problem: Nicht alle Zellen in Kultur sind in den selben Zyklusphase im Beginn der Experiment. Dafür muss man die Zellen synchronisieren, so dass alle in der gleichen Zyklusphase die Experiment beginnen => Synchronisierung

• Mitogen wird aus Medium rausgenommen (Serumentzug, die Wachstumsfaktoren & Mitogene enthalten) => Kulturmedium rausnehmen & serumfreies Medium zugeben

Ohne Mitogene & Wachstumsfaktoren gehen die Zellen aus der Zellzyklus raus. Zellen akkumulieren in G1. Dann kann man den Versuch starten. 

• Zugabe von Inhibitoren des Zellzyklus, z.B. Nocodazol => Akkumulation in M-Phase; Aminopterin => Blockierung in S-Phase

Dabei akkumulieren nicht alle Phasen in einer Phase, trotzdem der Schwerpunkt liegt bei einer Phase. 

• Elutiation 

Zellen je nach Dichte separieren => entsprechend je nach Größe und Dichte eluiert. Nach der Zellzyklus verändern die Zellen ihre Größe => Zellen kann man die Zellen in G1-Phase isolieren. 

=> Zellschädigung verfassen

Apootose: Zelle & Nukleus kondensiert/schrumpft und fragmentiert. Plasmamebran schnürt enthüllte Fragmente des Cytosols (Organellen, Nukleus usw.). Sie werden in vivo von Immunzellen phagocytisiert => keine Entzündungsreaktion. 

Apoptose kann entweder wegen der Zellalterung (über extrinsische Signalweg, Todesrezeptoren) oder aufgrund von intrazellulären Schädigung entstehen (über intrinsische Signalweg). 

In vitro hat man bei der Apoptose irgendwann auch sowas wie Nekrose. Am Ende wird in der Zellkulturplatte irgendwelche Organellen rumschwimmen, da die membranümhüllten Blabbs nicht phagotyciert werden (=> Immunzellen fehlen) => Sekundäre Nekrose

ATP-Gehalt sinkt sehr stark bei der Apoptose. 

Signal: Bioluminiszenz

• ATP & O2 & Luficerase wandeln Luciferin in Oxlyluciferin um 
• Dabei wird Licht erzeugt und diese lässt sich verfassen

Je mehr ATP in der Zellen vorhanden ist, umso höher ist Signal. Tote Zellen produzieren entsprechend sehr geringe Signal. 

• Messbereich über 6 Größenordnungen
• Assay ist exrem sensitiv

Anschließend kann man auch den Anteil an ADP in der Zelle messen => ADP-Converting-Reagenz => frisch generierte ATP => Luciferase-Assay wiederholen.

Membran einer apoptotischen Zellen verändert sich. Membrankomponenten verändern ihre Lage (z.B. Phosphatidylserine, die in vitalen Zellen nach innen zeigen, flippen und zeigen außen bei der Apoptose). 

Diese extrazellulär exponierte Phosphatidyserine (PS) kann mittels Annexin erfasst werden. Diese markierte Annexin bindet selektiv an PS. Signal wird ausgelesen. 

Je mehr Annexin-Signal, desto mehr Zellen befinden sich in Apoptose. 

Färbung mit Propidiumiodid der membranenthüllten Vesikeln => zur Erfassung von sekundäre Nekrose.

Fluoreszenzmarkierte Caspase-Substrat => Sobald Caspase diese schneidet, dann wird diese Fluoreszenz von der Peptid frei => Fluoreszenz wird gemessen. 

Je mehr Signal, desto mehr Zellen befinden sich in der Apoptose. 

=> Ist Caspasekaskade aktiv?

Bei der Apoptose wird DNA fragmentiert und diese führt zu freien Nukleinsäure-Enden (3’-OH-Gruppen werden freigesetzt). Diese kann man mithilfe von einem Enzym, Deoxynucleotidtransferase, markieren. Diese markierte Enden kann mit BrdU verfasst werden. Gehalt an BrdU kann mit entsprechenden Antikörper gemessen werden (+ Fluoreszenz markiert). 

z.B. Cis-Reporter System

Zellen werden hier gentechnisch geändert, so dass sie ein Reporerplasmid tragen. Als Reporter dienen z.B. Fluorophore (z.B. GFP). 

Oberflächenrezeptor wird aktiviert (unter bestimmten Bedingungen) => Signalweg wird aktiviert => Transkriptionsfaktoren aktiviert => Diese binden an Response-Element von diesem Gen => Dieses Response-Element (TRE) packt man auf das Reporter-Plasmid. 

Wenn der Signalweg unter den Versuchsbedingungen aktiviert wird, dann wird der Reporter exprimiert. Diese kann man messtechnisch verfassen. 

Endpunkt-Assay misst man zu einem bestimmten Zeitpunkt. 

Live Cell Analysis/Imaging => dabei wird kontunierlich die Reaktivität der Zellen erfasst.

Dafür wird ein permanentes Assay installiert, die den Messparameter ständig über die Zeit erfasst (+ Mikroskopieren im Inkubator). 

Dynamik der Zellen wird dabei sehr gut erfasst => sehr wertvoll für ZKT

• Einbringen von kontaminierter Zellen (z.B. von einem anderen Labor und es kann sein, dass die Kontamination sich im Labor über Kulturmedium ausbreitet)
• Laborgeräte, Glas- und Plastikwaren => Rückstände von Desinfektionsmittel/Detergenzien darauf
• Kontaminierte Medien, Reagenzien, z.B. chemische Kontamination => Metallionen/Endotexine in Medien
• Luftkeime (Leute, die im Labor arbeiten, sind auch eine Kontaminationsquelle)

• Testen der eingebrachten Zellen (Quarantäne; separat bewahren, bis man sicher ist, dass die keine Kontamination haben)
• Aseptisches (keimfrei) Arbeiten
• Desinfektionsmittel (Ethanol, Isopropylalkohol) => wegwischen notwendig
• Hygiene (Hände, Arme waschen)
• Regelmäßiger Test/Überprüfung laufender Kulturen auf Kontamination
• Antibiotika nur im Bedarfsfall

=> nicht endlos haltbar, da die MO resistent werden und die aktive Konzentration klingt nach und nach ab, so bald sie mit Medium in Kontakt gebracht werden

• Sezieren (öffnen und anatomisch zerlegen) von Organismen (z.B. Maus) getrennt von Zellkulturen

• MO konkurrieren mit Zellen um Nährstoffe im Kulturmedium.
• Sie sektetieren saure/alkalische Stoffwechselprodukten, welche das Zellwachstum inhibieren. 

MO können unterschiedliche Substanzen in Kulturmedium abgeben => es kann zur pH-Verschiebung im Kulturmedium kommen, was Puffersystem im Medium nicht mehr schafft, das auszugleichen (gelbe Farbe bei Bakterienkontamination in Kulturmedium).

• MO produzieren H2O2 (oder Endotoxine) mit direkter Toxizität für die Zellen. 

=> führt zur Verlust von Zelllinien/chargen bzw. Produkten der ZKT

=> Experimentelle Resultate sind fragwürdig

• Dauereinsatz von Antibiotika stellt das Gefahr der Resistenzbildung (im Labor; Vernachlässigung der Grundregeln in aseptischen Arbeitens)
• Hintergrundkontamination: trotz Einsatz von Antibiotika (meistens bringe sie die MO nicht um, sondern verhindern deren Proliferation), bleibt eine gewisse Level von Hintergrundkontamination im Zellkultur (unterhalb der wahrnehmbaren Schwelle); wenige Bakterien fallen zw. vielen Zellen nicht auf. 
• Antibiotika sollen deswegen strategisch eingesetzt werden: z.B. kurzfristig kritische teure Experimente abzusichern. 
• Niemals soll die Antibiotika unterdosiert werden (Antibiotika sind unterschiedlich stabil in verschiedene Kulturmedien). 
• Simultane und konsekutive Kombination von Antibiotika ist problematisch (was nicht vorher getestet wurde, kann es dazu kommen, dass die Zellen nicht mehr proliferieren). 
• Generell sind antibiotikafreie Kultur vorzuziehen.

• Sie benutzen keine Glykose, sondern Arginin zur ATP-Synthese. 

z.B. Zellkultur hört plötzlich auf, zu wachsen, und man sieht keine Kontamination. Wenn man Arginin zu dieser Zellkultur gibt, dann fängt Zellkultur wieder anzuwachsen.

Verdacht: Kultur ist Mycoplasmen kontaminiert. Mycoplasmen nehmen Arginin von Zellmedium weg und deswegen faellt es den Zellen und sie stoppen die Proliferation. Man kann die Mycoplasmen nicht mit bloßem Auge oder mit Lichtmikroskop sehen. 

Sie können vielfältig Effekte in den Zellkulturen beeinflussen: (nicht nur Argininmangel im Medium) z.B. Metabolismus, Morphologie und chromosomale Aberrationen usw.

Fluoreszenzfärbung der DNA mit DAPI in der Zellkultur

Nachteil: Zellkultur überlebt diese DNA-Färbung nicht, deswegen soll man eine Testkultur machen. 

Ablauf: DAPI in Methonol gelöst zugeben (inkubieren 15 min, 37 ºC), mit PBS waschen, mikroskopieren (schneller Prozess).

PCR-Detektion

Vorteil: hohe Nachweisempfindlichkeit, auch geringe Mengen von Mycoplasmen können hier nachgewiesen werden. Und sie detektieren alle bekannnten Mycoplasmen-Spezies von Säugerzellen. 

Primer bei PCR hybridisieren konservierten Regionen der 16S ribosomalen RNA im Mycoplasmengenom. Sie zerstören nicht der Kultur. 

Aus dem Kulturüberstand wird etwas Kulturmedium (100 µl) genommen, in welcher Mycoplasmen gibt. Diese wird kurz erhitzt, so dass Mycoplasmen platzen und DNA zugänglich wird, und zentrifugiert. 2 µL von Überstand dieser Lösung genügt für eine PCR-Reaktion, um spezifische Region von Mycoplasmen zu amplifizieren. DNA wird auf Gel übertragen und mit Kontrolle verglichen. 

Vorteil: Man braucht nicht viel von Zellkultur und den Zellen geht’s weiterhin gut, wenn sie negativ getestet werden.

Antibiotika, Co-Kultur mit Makrophagen 

Nachbehandlung: Klonierung der Zelllinie u. erneuter Test auf Mycoplasmen

=> Vermischung von unterschiedlichen Zelllinien oder Vermischung von unterschiedlichen Differenzierungsstadien einer Zelllinie

z.B. bei einem Differenzierungsexperimenten mit pluripotenten Stammzellen; ausdifferenzierte Zellen und Vorstadien als Kontamination im selben Kultur

=> Konkurrierung von Zelllinien um Nährstoff 

• unterschiedliche Morphologie der Zelllinien

Es kann aber auch vorkommen, dass die Morphologie der Zellen auch wegen was Anderes beeinlusst werden.

Subconfluent: Zellen können proliferieren, da es genug Platz im Zellmedium gibt. 

Confluent: Zellen können nicht proliferieren, da es nicht genug Platz gibt. In diesem Zustand kann es sein, dass die Morphologie geändert wird, da sie sich nicht mehr in dem Zellzyklus befinden und die Genexpression ändern. 

Substanzen im Nährmedium hat auch Einfluss auf die Morphologie. 

• Niedrigere Syntheserate (z.B. Hybridomzelle für die Produktion der monoklonaler Antikörper)

Deswegen ist es wichtig die Zelllinie nicht nur morphologisch als auch auf der Genebene charakterisiert wird => Authentifizierung von Zelllinien, um nachzuweisen, um welche Zelllinie sich handelt und zu sehen ob es Kreuzkontamination gibt.

• Karyotyping (chromosomale Analyse)
• Isoenzym-Analyse
• Analyse von STRs (short tandem repeats)

Klonierung identifizierter Zielzellen & erneuter Test auf Kreuzkontamination

• Versorgung der Zellen mit essentiellen Substanzen/Nährstoffe für das Überleben der Zellen
• Neutralisierung von Abfallprodukten der Zellen 
• Ersatz der Immunabwehr

• Aus Froschembryonen hat er das Neuralrohr entnommen (Vorform des zentralen Nervensystems) und auf eine Objektträger draufgelegt.
• Aus dem Forschlympe (Kulturmedium, Körperflüssigkeit von Spender)  hat er auf diesen Neuralrohr gegeben, damit es vollständig bedeckt war (Kulturmedium) und antrocken lassen.
• Dann hat er diesen Objektträger nach unten (upside down) gedreht, so dass diese Lympflüssigkeit bisschen hing. Und dann hat er es auf mulden Glas gesetzt.
• Durch Glas (Glas auf Glas) hat er es vor Kontamination geschützt.
• Er konnte Wachstum von Neuronen beobachten!

Milestones:

• Er hat ein funktionierendes Medium generiert.
• Er hat eine besondere Kulturform entwickelt => hanging-drop culture 
• Er hat eine Kulturgefäß aus Glas entwickelt, wobei er das Wachstum beobachten konnte und welche Kontamination von außen aufhält. 

• Komponenten: AS, Vitamine, Kohlenstoff (z.B. Glucose), Serum bzw. Serumersatzstoffe, Spurenelemtente, anorganische Salze, Fettsäuren, Lipide, Puffersubstanz, pH-Indikator
• Geprüfte Qualität
• Gebrauchsfertige Lösung/Konzentrat, die man mit sterilen Wasser komplementieren kann, oder als Pulvermischung (niedrige Gewicht, lange Haltbarkeit, geringe Stauram, die in Wasser gelöst wird).