Bakteriengenetik Neuhaus

Definition: Jede vererbare Veränderung der DNA Sequenz

Spezielle Mutationsereignisse:

• Punktmutationen: Veränderung von einigen wenigen Basen, keine Veränderung des Reading Frames
• Insertion oder Deletion:
  • Falls durch drei teilbar => keine Veränderun des Leserahmen
  • Sont Veränderung des Leserahmens
• Zufällig oder gezielt
• Klein vs Groß (Inversionen, große Indels)
• selektierbar vs. nicht selektierbar
• Nonsense Mutation => Codon für AS wird zu Stopcodon
• Missense Mutation => Codon für AS wird zu Codon einer anderen AS
• Silent Mutation => Codon für AS wird zu Codon der gleichen AS

Spontane Mutationen entstehen durch chemische Veränderungen der DNA Komponenten oder Fehler während der replikation. Andere können durch äußere faktoren entstehen wie akyllierende Agenzien oder UV Strahlung. Durch Mutatorgene kann zum Beispiel die Mutationsrate anderer Gene in verschiedem starken Ausmaß erhöht werden.

Wird verwendet um die wichtigsten AS eines Proteins herauszufinden. Er wird bevorzugt mit Alanin durchgeführt aber es sind auch Valin, Leucin und Cystein möglich. Hierbei wird jede einzelne Aminsäure durch ortspezifische Mutagenese durch z.B Alanin ersetzt und überprüft ob das Protein hierdurch seine Funktion verliert. Abhängig davon kann die Wichtigkeit der ersetzten AS eingeschätzt werden.

PCR bei der die natürliche Fehlereinbaurate der zur Amplifikation verwendeten DNA-Polymerase erhöht wird, zum Beispiel durch die Verwendung von Mn2+ anstatt Mg2+ im Reaktionspuffer. Allgemein ist die DNA Polymerase sehr spezifisch und macht wenig Fehler, durch die Veränduerung der Reaktionspuffers kann jedoch die Fehlerrate erhöht werden.

CRISPR/Cas ist ein Abwehrsystem von Bakterien gegen Bakteriophagen. CRISPR ist hierbei ein Genabschnitt des Bakterium auf dem zwischen palindromischen Repeats kleine DNA Stücke von Viren DNA zu finden sind. Befällt nun ein Phage ein Bakterium so kann dieses in manchen Fällen einen Teil der inserzierten DNA kopieren und in den CRISPR einfügen. Das eigentliche Abwehsystem basiert jedoch auf dem Cas Komplex. Dieser verwendet die Stücke der transkribierten CRISPR DNA und bildet einen Komplex mit einer guideRNA. Dieser Komplex sucht nun in der Zelle nach Fremd DNA die zur cRNA passt, da es sich dabei um Virus DNA handeln muss. Wird eine solche DNA gefunden schneidet der Cas Komplex die Fremd DNA an der Stelle und macht so die Virus DNA unschädlich.

Das CRISPR/Cas Komplex hat große Bedeutung für die Gentechnik da es programmierbar ist. Das heißt das Cas Protein schneidet Sequenz passend zu der RNA mit der es ausgestattet ist. Das erlaubt einem Gentechniker ein enorm spezifisches schneiden und einfügen an beliebigen Stellen in einer DNA Sequenz und kann vor diesem Hintergrund ein sehr mächtige Tool sein.

Die kann nützlich sein um den Erfolg eines Rekombinationsereignis zu überprüfen bzw. danach zu selektieren. Für Bakterien sind die durch das Cas Protein erzeugten Doppelstrangbrüche tödlich. Programmiert man also das Cas Protein mit der Sequenz an der die rekombination mittels lambda red stattfinden soll, so schneidet das System nur falls die Rekombination nicht geklappt hat, denn dann ist die Ausgangssequenz immer noch genauso vorhanden. Die Bakterien überleben also nur falls die homologe Rekombination mittels Lambda Red funktioniert hat.