Bakteriengenetik Neuhaus

Suizid Plasmid benötigt ein bestimmtes Protein zur Replikation am Ori (z.B lambda pir). Wird nun das Plasmid an einen Bakterium übergeben, dass nicht das nötige Protein  besitzt so geht das Plasmid verloren und auch potentielle Eigenschaften wie Resistenzen etc. die auf dem Plasmid codiert waren. Nur solche Bakterien bei denen einen homologe Rekombination an einer gewünschten Zielstelle (z.B hinter einem Promotor) stattgefunden hat, behalten die Eigenschaften des Plasmids da diese nun in das Bakteriengenom integriert wurden. Nun kann ganz einfach nach solchen Bakterien selektiert werden die das Plasmid in ihr Bakteriengenom eingefügt haben.

• Man muss darauf achten, dass der Ori im Wirtssystem nicht replizirebar ist
• Man benötigt einen selektierbaren Marker um Integranten zu selektieren.
• Plasmid muss tranferierbar z.B vie Konjugation sein
• Attachment site von Wirt und Plasmid komplementär zueinander

Hierbei spielt das lac Operon eine entscheidende Rolle. Das lacZ Gen produziert hier die beta-Galactosidase welche das farblose X-Gal zu Galactose und einem blauen Farbstoff abbaut. Dies kann hilfreich sein um zu Überprüfen ob man ein DNA Stück erfolgreich in ein Bakterienplasmid einbauen konnte. Wurde das DNA Stück erfolgreich im lacZ Gen eingebaut so kann das Bakterium keine beta-Galactosidase produzieren und kein X-Gal abbauen. Das Bakterium bleibt also weiß. War der insert nicht erfolgreich ist das lacZ Gen unbeschädigt und das Bakterium färbt sich blau. Anschließend selektiert man also die weißen Bakterien, da diese das Insert besitzen.

Der lac Promotor ist bistabil. Erhöht man die IPTG Konzentration so wird nicht wie man vielleicht erwarten könnte pro Bakterium etwas mehr Protein produziert. Der Zustand eines jeden Bakteriums ist binär, d.h jedes Bakterium produziert entweder Protein oder nicht. Für bestimmte Versuche kann diese Eigenschaft ungünstig sein. Asußerdem bleibt der Promotor bei niedrigeren IPTG Konzentrationen angeschaltet wenn man mit einer hohen Konzentration beginnt und dann die Konzentration absenkt, als wenn man mit einer niedrigen Konzentration beginnt und dann die Konzentration erhöht.

Dies kann durch ein sogenanntes Screening geschehen. Zunächst kann man die Bakterien ohne Plasmid durch eine Antibiotikaselektion entfernen. Anschließend kann man die Bakterien ohne DNA Insertion durch eine Blau/Weiß Selektion entfernen. Um dann zwischen den Bakterien mit dem gewollten Insert und denen mit einem zufälligen Insert zu unterscheiden kann man ein Replica Plating verwenden. Hierbei erzeugt man eine zweite Platte in dem von jeder Kolonie einen kleinen Teil entnimmt und selektiert diese zum Beispiel mit den Antibiotika. Für den Fall das es sich um selektierbare Mutanten handelt, sind dies diejenigen die auf der zweiten Platte zu sehen sind. Falls es sich um nicht-selektierbare Mutanten handel, sind dies dijenigen die es auf der ersten Platte gibt aber nicht auf der Kopie.

Wird verwendet um mehrere DNA Fragmente zusammenzufügen. Will man also zwei DNA Doppelstränge zusammenfügen so müssen diese einen Overlap aufweisen, dieser kann auch zum Beispiel via PCR erzeugt werden. Die hinzugegebene Exonuclease schneidet die 5' Enden der beiden DNA Stränge zurück, sodass eine Lücke entsteht. Hier können nun die 3' Enden der beiden Stränge "annealen". Zum Abschluss schließt die DNA Polymerase die Lücken und die DNA Ligase schließt die Schnitte.

Hierfür kann das lambda Red recombeneering System verwendet werden. Hierbei katalisieren die Lambda Red Enzyme Exo, Beta und Gamm die homologe Rekombination mit einem gewünschten zu insertierende DNA stück. Gam verhindert hierbei dass die Nukleasen des Bakteriums die eingebrachte DNA zerstören. Exo ist eine exonuclease welche einen DNA Strang zersört und nur einen Einzelstrang zurücklässt. Beta beschützt den Einzelstrang welcher normalerweise vom Bakterium abgebaut werden würde.

Der Lambda Phage. Man benötigt die linearisierte DNA die inserziert werden soll und außerdem die drei Lambda Red Enzyme Exo, beta aund Gam. Für eine single Strand DNA braucht man Exo nicht da diese den zweiten DNA Strang abbaut.