Bakteriengenetik Scherer
Vorlesung 1
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Cartes-fiches
Welche drei Komponenten hat die in der Zeichenfolge von Nukleinsäuremolekülen transportierte biologische Information?
- Strukturelle Komponente (Biochemie der Nukleinbasen)
- Eine komplementäre Komponente (Fähigkeit Doppelstränge zu formen)
- Eine genetische Komponente (Translation)
Nennen Sie 5 Ebenen, auf denen biologische Information in einer Bakterienzelle gespeichert ist
- Level 5: Die raumzeitliche Gesamtheit der Zelle
- Level 4: Die 3D Struktur der Zelle (Cytoskelet, Zellwand etc.)
- Level 3: Die 3D Struktur der biologischen Membranen
- Level 2: Die (nicht-lineare) Sequenz der Polysaccaride ('sugar code')
- Level 1: Genetische Information codiert durch die lineare Sequenz der Nukleinsäuren
Was ist ein Gen?
- Ein Gen ist eine Region von DNA oder RNA auf dem Chromosom welche vererbt wird.
- Ein Gen ist eine Region von DNA oder RNA die eine biologisch Funktion codiert.
Welche Komponenten hat die bakterielle RNA Polymerase?
Eine RNA Polymerase besteht aus mehreren Untereinheiten:
- 2 alpha Untereinheiten: Enzym Zusammbau, Promotorerkennung, Bindung von Aktivatoren
- beta und betaUntereinheit: katalytisches Zentrum
- sigma Untereinheit: Erkennt und bindet den Promotor
- omega Untereinheit: Chaperon Funktion
Bescheiben Sie den bakterielen Transkriptionsvorgang.
1) Template ERkennung
Polymerase erkennt mit Hilfe des sigma Faktors die Promotorbindestelle und bindet an den Promotor
2) Enstehung der Trankriptionsblase
Die Helikase Aktivität der RNA Polymerase entspiralisiert die Doppelhelix
3) Initiation der Transkription
RNA Synthese beginnt in der Transkriptionsblase
4) Elongation
Mit fortschreitender Verlängerung wird die DNA vo der Polymerase kontinuierlich abgewickelt, durch aufbrechen der H-Brücken.
5) Termination
spezifische palindromische DNA-Sequenz signalisiert der RNA Polymerase zu stoppen
Nennen Sie zwei fundamentale Unterschiede zwischen prokaryoter und eukaryoter Genexpression.
1.Unterschied: Bei Prokaryoten ist die Translation direkt an die Transkription gekoppelt, wohingegen bei Eukaryoten die mRNA zunächst ins Cytoplasma gebracht wird und dort erst von den Ribosomen tranlatiert wird.
2.Unterschied: Eukaryotsiche mRNA wird noch prozessiert, Introns (also nicht codierende Gensequenzen) werden herausgespliced. Dies passiert bei prokaryotischen Zellen nicht, da hier keine Introns existieren.
Wie wird die bakterielle Transkription terminiert?
Durch eine palindromische Sequenz entsteht eine Haarnadel Struktur welche den Trankriptionsvorgang stoppt (Intrinsische Termination). Alternativ gibt es auch eine rho-abhängige Termination, bei der das Rho Protein die Trankription beendet, nachdem die RNA Polymerase durch sogenannte Transkriptionspausestrukturen verlangsamt wird kommt.
Die Gleichgewichtskonstante der Bindung der RNA Polymerase an einen bakteriellen Promoter beträgt etwa K = 2 x 107 M-1. In Gegenwart des Repressors beträgt sie etwa 109 M-1 Was könnte die biologische Funktion des Unterschiedes sein?
Die Affinität der RNA-Polymerase zum Promotor wird bei Anwesenheit des Repressors erhöht. Auf diese Weise ist es möglich die Zelle schnell von einem repressiven Zustand in einen exprimierenden Zustand umzustellen. Sobald sich der Repressor löst wird das Gen direkt abgelesen. Die RNA-Polymerasen warten also an den Stelle wo sie später aktiv werde müssen. Gene die sehr schnell aktiviert werden müssen sind so reguliert. Zum Beispiel bei der Lactose Regulation muss der Organismus in der Lage sein, schnell zwischen Glucose und Lactoseals Quelle wechseln zu können.
Nennen Sie die Strukturelemente eines bakteriellen Promoters und ihre Funktion.
Meistens 3 Komponenten:
- -35 Region: sigma Faktor Bindestelle TTGACA
- -10 Region: Pribnow - Box, Erkennungssequenz für die RNA Polymerase (bindet Core-Enzym)
- Das Ende des Promotors bestimmt den Startpunkt der Transkription
Wie kann man Länge und Konzentration einer mRNA bestimmen? Was sind die Vorteile und Nachteile der Methoden?
Reverse Transcription PCR
- Nach RNA Reinigung wird die RNA mittels RT in cDNA umgeschrieben
- cDNA kann mit PCR vermehrt werden und die Reaktion wird mit Hilfe von Fluoreszenz überwacht (qPCR)
- Hieraus kann die Menge der RNA zu einem gewissen grad nachfolzogen werden
- Nachteil: Exponentielles Wachstum der cDNA stellt Schwierigkeiten bei der genauen Quantifizierung dar
Northern Blot
- RNA wird mit Gelelekrophorese aufgetrennt und auf eine Membran übertragen
- Nun werden Sonden hinzugegeben welche komplementär zur RNA sind und an ein radioaktives Isotop gebunden sind oder eine andere luminiscente Markierung besitzen
- Die Sonden hybridisieren mit der RNA und man kann Konzentration und Menge mit Hilfe von Densiometrie bestimmen.
- Nachteil: Instabilität der RNA führt zu einer hohen Verunreinigungsrate beim Nachweis
Array Technologie
- Bestimmung des gesamten Trankriptoms
- sehr kompliziert, evtl schlechte Ergebnisse
Deep Sequencing
- Bestimmung des gesamten Transkriptoms
- Dauert lange und ist teuer
Wie bestimmt man den +1 der Transkription?
Primer Extension Technologie.
- An isolierte RNA wird ein cDNA Primer hybridisert
- Mit Hilfe von Reverser Transkriptase wird Primer bis an das 5' Ende der RNA verlängert
- RNA und cDNA können wieder denaturiert werden
- Durch Untersuchung des Primers in einer Gelelektrophorese (z.B mit Sanger Sequenzierung) kann das 5' Ende der RNA und damit auch der +1 der Transkription bestimmt werden
Erklären Sie, wie man durch ein DNA footprinting Experiment die Bindungsstelle der RNA Polymerase an den Promoter herausfinden kann.
Zu Untersuchender DNA bereich wird amplifiziert und markiert (z.B durch ein Isotop). Ein Teil der amplifzierten DNA wird mit RNA Polymerase versetzt der andere Teil nicht. Nun gibt man zu beiden Teilen DNase I hinzu welche die DNA an unterschiedlichen stellen schneidet, jedoch nicht an den Stellen an denen die RNA Polymerase gebunden ist. Vergleicht man nun die Gelektrophorese der DNA Stränge mit RNA Polymerase und denen ohne, so wird man feststellen das einige Banden nur bei den DNA Stängen ohne RNA Polymerase zu finden sind. Dies liegt daran das im anderen Fall hier die DNA nicht geschnitten werden konnte, da hier die RNA Polymerase gebunden hat. Man hat also die Bindungstelle der RNA Polymerase gefunden.
