Bakteriengenetik Neuhaus

Zugrunde liegen die verschiedenen Regulationsmechanismen von Plasmiden in Bakterien. Hier sind zu nennen

• Regulation mit komplementärer RNA
• Regulation mit Protein und Antisense RNA
• Regulation mit Coupling

Theta Replication:

• Bidirektional: Replikation beginnt am Oriv. Es wird in entgegengesetzte Richtung dupliziert, bis die Replikationsgabeln genau gegenüber vom ORI zusammenkommen.
• Unidirektional: Replikation beginnt am Oriv. Replikation verläuft in eine Richtung runderherum bis sie wieder zurück zum ORI kommt.

Rolling Circle Replikation

1. Am DSO (Double Strand origin) bindet das RepA Protein und beide Stränge formen einen loop. Das Protein RepA zerschneidet  anschließend einen der beiden DNA-Stränge und bleibt an dessen 5' Ende gebunden.
2. Die DNA-Polymerase III benutzt das 3' Ende des zerschnittenen Strangs als Primer und beginnt von dort mit der Synthese eines neuen Strangs. Der zerschnittene Strang wird dabei vom Plasmid abgerollt und liegt zunächst als Einzelstrang vor
3. Der zerschnittene Einzelstrang wird wieder zu einem Ring geschlossen. Vom SSO (Single Strand Origin) ausgehend kann nun mit Hilfe der DNA-Polymerase der Strang zu einem Doppelstrang ergänzt werden.

F-Plasmid: 1

P1 Prophage: 1

RK2 (in E.coli): 4-7

pBR322: 16

pUC18: 30-50

pIJ101: 40-300

Regulation durch komplementäre RNA:

• Replikation wird durch RNA 1 reguliert
• RNA II initiert die Replikation indem sie ein stabiles RNA-DNA Hybrid in der Nähe des ORI erzeugt, welcher durch RNase H  prozessiert werden kann
• Ist jedoch RNA I vorhanden so form sie einen "Kissing complex" mit RNA II welcher durch das Rop Protein stabilisiert wird. Hierdurch kann die RNA II nicht mehr die Replikation des des Plasmids initieren

Regulation durch Protein und Antisense RNA

• Vor dem RepA(essentiel für Plasmidreplikation) Promotor gibt es den CopB Promotor. Das CopB Protein unterdrückt den RepA Promotor um die Plasmidreplikation zu limitieren
• Es existiert außerdem eine CopA Promotor in Gegenrichtung zum RepA Promotor woraus eine Antisense RNA entsteht welche mit der RepA RNA einen Duplex formt und somit ebenfalls die Produktion von RepA limitiert

Regulation durch Coupling

• Bei niedriger Plasmidkonzentration bindet RepA nur an ein Plasmid und repliziert dieses
• Bei höherer Konzentration hingegen bindet es zwei Plasmide gleichzeitig und verhindert so die Replikation (handcuffing)

Partioning

1. Plasmide binden an eine spezifische Stelle der Proteinmembran und werden auseinander gezogen wenn die Stelle sich bei Zellteilung ebenfalls teilt
2. Plasmide binden aneinander und anschließend an eine spezifische Stelle bevor sie bei Zellteiltung auseinander gezogen werden
3. ParM Protein sucht und findet die Plasmide und baut eine Art verbindung zwischen beiden auf. Die Verbingung verlängert sich so lange bis die Plasmide and die jeweils gegenüberlegienden Zellmembrand gedrückt werden. Die Verbindung wied Depolymersiert und die Zellteilung kann beginnen

Typ I TA-System:

• Als Toxin wird ein stabiles Protein hergestellt, als Antitoxin eine instabile Antisense RNA, welche die RNA des Toxins zu einem Duplex bindet und somit den Zelltod verhindert

Typ II TA-System:

• Antitoxin und Toxin sind beides Proteine wobei das Antitoxin das Toxin zu einem Komplex bindet, welcher wiederum den Promotor des TA-Systems inhibiert

Typ III TA-System:

• Antitoxin ist eine RNA welche das Toxin Protein bindet und den Zelltod verhindert.

Donorzelle kontaktiert Rezeptorzelle mit Hilfe eines Pilus oder ähnlichem. Die Rezeptorzelle wird näher gebracht und es bildet sich eine Pore sobald die beiden Zellmembranen angrenzen. Das Coupling Protein signalisiert, dass ein Kontakt mit der Empfängerzelle hergestellt ist. Anschließend schneidet die Relaxase einen Einzelstrang des Plasmids amd ORI. Eine vom Plasmid kodierte Helicase separiert dann die Stränge der plasmid DNA. Nun wird die Relaxase welche am 5' Ende der DNA gebunden ist in die Donorzelle transportiert und mit ihr auch der DNA Einzelstrang. Hier wird die DNA vpn der Relaxase wieder zirkularisiert und eine Primase baut den komplementären Strang auf, sodass wieder eine Doppelsträngiges Plasmid entsteht. Analog wird im Empfänger auch wieder ein komplementärer Strang produziet. Beide Zellen haben nun eine Kopie des Plasmids

1. Eine Maus wird mit ungefährlichem R-Strang von Strepptococcus pneunomiae infiziert und überlebt
2. Maus wird mit tödlichem S-Strang von Strepptococcus pneunomiae infiziert und stirbt
3. Maus wird mit abgestorbenen S-Strang infiziert und überlebt
4. Gleiche Maus wird anschließend mit ungefährlichem R-Strang infiziert und stirbt

=> Genetisches Material kann von einer Zelle in eine andere Übertragen werden

Das F Plasmid ist im Genom der Bakterien integriert. Zellen mit F Plasmid heißen F+ Bakterien. Transfer funktioniert über Pili. Genom wird einsträngig am Ori geschnitten und der Teil des Genoms der dem F Plasmid entspricht wird übertragen. Das F Plasmid wird über homologe Rekombination ins Rezeptorgenom eingebaut.

Je nach dem wie lange es dauert ein Gen via Konjugation zwischen 2 Bakterien zu übertragen wurde eine Map erstellt. So konnte man Genkarten der Plasmide erstellen, deshalb sind alte Genkarten in Minuten angegeben.