Prinzipien Biochemie TP
Prinzipien der Versuche aus dem Biochemie TP - Med2 HS18 UniFr
Prinzipien der Versuche aus dem Biochemie TP - Med2 HS18 UniFr
Prinzipreaktion und Erklärung zur GOD/POD-Methode? Dilationsfaktoren?
Prinzipreaktion siehe Bild.
Glucose wird oxidiert und entspricht nach Reaktion einem Wassermolekül. ABTS (oxidiert) wird Blau-Grün. Dies kann durch Photometer gemessen werden.
Dilutionsfaktoren: Serum 1 und 2 f=5 Serum 3 f=15
Prinzip zur Calciumbestimmung im Serum?
Calcium bindet an Methylthymolblau und bildet so gefärbten Komplex, der im Photometer messbar ist. Färbung ist proportional zur Menge des Komplexes.
Prinzip und Graphen der Vmax- und Km-Bestimmung?
Prinzip: Vmax ist die maximale Umsatzrate eines Enzyms (hier alkaline Phosphatase). Km ist die Michaelis-Menten-Konstante = Substratkonzentration bei 1/2 Vmax
Nach Experiment Michaelis-Menten und Lineweaver-Burk-Plot aufstellen und die umgesetzte Substratmenge über (v) = E(A) x 10.8 berechnen.
Prinzip zu Bradford? Verdünnung?
Eiweisse in Serum binden an Bradford-Reagenz (Coomassic-Blue). Komplex verfärbt sich proportional zur Menge.
Testserum wird 1:1000 verdünnt mit NaCl-Lösung -> also 1 Teil Serum und 999 Teile NaCl-Lösung
Prinzipreaktion und Erklärung zu GOT/ASAT? Berechnung?
Reaktion siehe Bild.
1. Reaktion ist eigentlich reversibel, man kann aber durch kontinuierliche Entfernung von Oxaloacetat auf die Enzymaktivität schliessen sofern MDH im Überschuss vorhanden ist.
NADH-Abhnahme wird mit Photometer gemessen. Der Abfall der NADH-Konzentration ist linear zur GOT-Aktivität.
Berechnung: Absorptionen voneinander substrahieren (E1 - E0, E2 - E1, etc.) und davon Durchschnitt berechnen (deltaE/min). deltaE/min x 2353 = Aktivität
Prinzipreaktion und Erklärung zu GPT/ALAT? Berechnungen?
Reaktion siehe Bild.
Pyruvat wird kontinuierlich zu Lactat durch LDH. NADH Abnahme kann durch Photometer gemessen werden. Abfall der NADH-Konzentration ist linear zur GPT-Aktivität.
Berechnung: Absorptionen voneinander substrahieren (E1 - E0, E2 - E1, etc.) und daraus Durchschnitt berechnen (deltaE/min). deltaE/min x 2353 = Aktivität.
Prinzip zur Blutgruppenbestimmung?
Prinzip: Im Blut sind neben RBK auch Antikörper für fremde Blutgruppen. Kommt ein solcher Antikörper (eg. Anti-A) mit einer Blutgruppe in Kontakt (eg. A), koaguliert das Blut. Einfaches Testen durch Mischen.
Wird auch durch Zentrifuge gemacht. Mischen von Antiserum und RBK -> Zentrifugieren -> Bei Kogaulation bleiben RBK oben liegen, sonst wandern sie nach Unten.
Prinzip zu Rhesusfaktorbestimmung?
Rhesusfaktor ist abhängig von 3 Faktoren (D, C, E) wobei C=dominant und c=rezessiv. Sobald 1 dominanter Faktor auf Chromosom -> Rhesuspositiv.
Prinzip zu Drabkin? Verdünnung?
Prinzip: Hb ist im RBK. Daher muss zuerst Hämolyse stattfinden, danach kann Absorption mit Photometrie gemessen werden, die in direktem Zusammenhang mit der Menge steht.
Sample hat Verdünnung von 1:251!
Prinzip zur Hct-Bestimmung? Berechnung?
Hct = VRBK / VBlut Auftrennen durch Zentrifuge und danach Verhältnis messen.
Berechnung: Anzahl RBK in 1 mm3 Blut sind ca. 5 x 10^6. Daraus lässt sich MCV berechnen und MCHC (= Menge Hb im Blut/Hct
Prinzip zur Serumeisen-Bestimmung? Berechnung?
Transferrin wird denaturiert (mit Chlorhydraten des Guanidin) und das Eisen gelöst und von Fe3+ zu Fe2+ reduziert (durch Ascorbinsäure). Freies Eisen bindet an Chelator Ferrozin zu rotem Komplex!
Berechnung: [Fe] in mikromol/L = (A2 (Extinktion nach Ferrozinzugabe) - A1 (Extinktion nach Zugabe von Chlorhydraten und Ascorbinsäure)) x 252.
deltaE (Extinktionskoeffizent von Ferrozin) = A2 - A1 x 252 = deltaE x 252
Prinzip zu Bindungskapazität von Eisen? Berechnung?
Freies Apotransferrin hat latente Bindungskapazität über Clor(id). Apotransferrin wird mit Eisen gesättigt. Danach wird Magensiumcarbonat hinzugegeben, damit sich das Eisen von Apotransferrin löst. Transferrin befindet sich nun in Lösung -> Berechnung ergibt die totale Bindungskapazität.
Berechnung:
SAMPLE: Bindungskapazität = (SA2 - SA1) x 252 x 3
BLANK: (C2 - C1) x 252 x 3 BLANK SOLLTE NULL GEBEN!!!
Latente Bindungskapazität kann berechnet werden, indem Serumeisen von totaler Bindungskapazität substrahiert wird.
Prinzip zur Bilirubinbestimmung in Serum? Berechnung?
Im Blut gibt es freies und gebundenes Bilirubin. Freies Bilirubin bindet sofort an Diazoreagens. Damit gebundenes auch bindet, muss es von Albumin getrennt werden (durch Koffein oder Methanol). Färbung kann nun bei 578 nm gemessen werden, woraus die totale Menge des Bilirubins berechnet werden kann.
Berechnungen:
[Bilirubin]total=185 x E
[Bilirubin]frei=246 x E
Für indirektes Bilirubin (gebunden): freies - totales
Prinizp der Cholesterinbestimmung im Blut?
Cholesterin kommt im Blut nur verestert vor. Cholesterol-Esterase spaltet es auf in Cholesterin und freie Fettsäuren. Ist Sauerstoff vorhanden, oxidiert Cholesterol über Cholesterol-Oxidase zu delta4-Cholesterone und H2O2. Peroxid wird von Peroxidase in Präsenz von 3-aminophenazon zu H2o und Quinon-Imin-Komplex abgebaut. Quinon-Imin-Komplex weist rote Färbung auf.
Berechnung: [Cholesterin] = E x 25.1
Prinzip HDL-Cholesterin-Bestimmung?
Mit MgCl2 können LDL und VLDL ausgefällt werden. HDL bleibt an Oberfläche gelöst (da sehr klein). Flüssige Phase mit HDL wird in Mikroküvette gegeben, zusammen mit PAP-Reaktiv. HDL löst sich, reagiert und bildet H2O2. H2O2 kann durch Reduktase zu H2O werden. PAP färbt sich mit H2O rot!
Berechnung: [HDL-Cholesterin] = E x 11.03
Was ist das Prinzip des Faktor V Leiden Mutations Experiments?
In der Elektrophorese werden die DNA-Stücke ihrer Länge nach unterschiedlich weit wandern, was erkennen lässt, ob eine Mutation vorliegt. (Bei Mutation entstehen durch die Restriktionsenzyme nur 2 geschnittene Teile, da durch die Mutation eine spezifische Schnittstelle verloren geht -> 1 längerer Teil)
Prinzip des ELISA Experiments?
Es gibt 2 verschiedene Varianten von ELISA:
- Sandwich: Detektion über Enzym-gekoppelte Antikörper:
- Antikörper (Ab) wird an Trägermittel gebunden, das Antigen (Ag) bindet nun an diesen Ab
- Enzym-gekoppelter Ab bindet nun an das Testantigen
- Umsetzung des Enzymsubstrats: Farbe oder Lumineszenz
- Menge kann nun mit der Standardkurve der bekannten Ag-Menge bestimmt werden
- Kompetitiver ELISA:
- Kompetition zwischen Träger-gebundenes-Antigen und freiem Antigen für eine limitierte Menge an markierten X-Abs
- Bestimmung der Menge des unmarkierten Ags: Standardkurve
Prinzip des SDS-Page Experiments?
Proteine werden durch SDS-Page (Gel-Elektrophorese) getrennt. Dies geschieht aufgrund von Grösse (je grösser desto langsamer) und Ladung (negative Ladung in Richtung positive Anode). Um aus einer Mischung zu erkennen, wie gross die Moleküle sind (und damit auch um welche Moleküle es sich handelt), braucht es eine "Leiter", welche parallel zu der Proteinmischung durch das Gel geschickt wird.
Bei der Leiter handelt es sich um bekannte Proteine mit ebenfalls bekannter Grösse.
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Cartes-fiches
Prinzipreaktion und Erklärung zur GOD/POD-Methode? Dilationsfaktoren?
Prinzipreaktion siehe Bild.
Glucose wird oxidiert und entspricht nach Reaktion einem Wassermolekül. ABTS (oxidiert) wird Blau-Grün. Dies kann durch Photometer gemessen werden.
Dilutionsfaktoren: Serum 1 und 2 f=5 Serum 3 f=15
Prinzip zur Calciumbestimmung im Serum?
Calcium bindet an Methylthymolblau und bildet so gefärbten Komplex, der im Photometer messbar ist. Färbung ist proportional zur Menge des Komplexes.
Prinzip und Graphen der Vmax- und Km-Bestimmung?
Prinzip: Vmax ist die maximale Umsatzrate eines Enzyms (hier alkaline Phosphatase). Km ist die Michaelis-Menten-Konstante = Substratkonzentration bei 1/2 Vmax
Nach Experiment Michaelis-Menten und Lineweaver-Burk-Plot aufstellen und die umgesetzte Substratmenge über (v) = E(A) x 10.8 berechnen.
Prinzip zu Bradford? Verdünnung?
Eiweisse in Serum binden an Bradford-Reagenz (Coomassic-Blue). Komplex verfärbt sich proportional zur Menge.
Testserum wird 1:1000 verdünnt mit NaCl-Lösung -> also 1 Teil Serum und 999 Teile NaCl-Lösung
Prinzipreaktion und Erklärung zu GOT/ASAT? Berechnung?
Reaktion siehe Bild.
1. Reaktion ist eigentlich reversibel, man kann aber durch kontinuierliche Entfernung von Oxaloacetat auf die Enzymaktivität schliessen sofern MDH im Überschuss vorhanden ist.
NADH-Abhnahme wird mit Photometer gemessen. Der Abfall der NADH-Konzentration ist linear zur GOT-Aktivität.
Berechnung: Absorptionen voneinander substrahieren (E1 - E0, E2 - E1, etc.) und davon Durchschnitt berechnen (deltaE/min). deltaE/min x 2353 = Aktivität
Prinzipreaktion und Erklärung zu GPT/ALAT? Berechnungen?
Reaktion siehe Bild.
Pyruvat wird kontinuierlich zu Lactat durch LDH. NADH Abnahme kann durch Photometer gemessen werden. Abfall der NADH-Konzentration ist linear zur GPT-Aktivität.
Berechnung: Absorptionen voneinander substrahieren (E1 - E0, E2 - E1, etc.) und daraus Durchschnitt berechnen (deltaE/min). deltaE/min x 2353 = Aktivität.
Prinzip zur Blutgruppenbestimmung?
Prinzip: Im Blut sind neben RBK auch Antikörper für fremde Blutgruppen. Kommt ein solcher Antikörper (eg. Anti-A) mit einer Blutgruppe in Kontakt (eg. A), koaguliert das Blut. Einfaches Testen durch Mischen.
Wird auch durch Zentrifuge gemacht. Mischen von Antiserum und RBK -> Zentrifugieren -> Bei Kogaulation bleiben RBK oben liegen, sonst wandern sie nach Unten.
Prinzip zu Rhesusfaktorbestimmung?
Rhesusfaktor ist abhängig von 3 Faktoren (D, C, E) wobei C=dominant und c=rezessiv. Sobald 1 dominanter Faktor auf Chromosom -> Rhesuspositiv.
Prinzip zu Drabkin? Verdünnung?
Prinzip: Hb ist im RBK. Daher muss zuerst Hämolyse stattfinden, danach kann Absorption mit Photometrie gemessen werden, die in direktem Zusammenhang mit der Menge steht.
Sample hat Verdünnung von 1:251!
Prinzip zur Hct-Bestimmung? Berechnung?
Hct = VRBK / VBlut Auftrennen durch Zentrifuge und danach Verhältnis messen.
Berechnung: Anzahl RBK in 1 mm3 Blut sind ca. 5 x 10^6. Daraus lässt sich MCV berechnen und MCHC (= Menge Hb im Blut/Hct
Prinzip zur Serumeisen-Bestimmung? Berechnung?
Transferrin wird denaturiert (mit Chlorhydraten des Guanidin) und das Eisen gelöst und von Fe3+ zu Fe2+ reduziert (durch Ascorbinsäure). Freies Eisen bindet an Chelator Ferrozin zu rotem Komplex!
Berechnung: [Fe] in mikromol/L = (A2 (Extinktion nach Ferrozinzugabe) - A1 (Extinktion nach Zugabe von Chlorhydraten und Ascorbinsäure)) x 252.
deltaE (Extinktionskoeffizent von Ferrozin) = A2 - A1 x 252 = deltaE x 252
Prinzip zu Bindungskapazität von Eisen? Berechnung?
Freies Apotransferrin hat latente Bindungskapazität über Clor(id). Apotransferrin wird mit Eisen gesättigt. Danach wird Magensiumcarbonat hinzugegeben, damit sich das Eisen von Apotransferrin löst. Transferrin befindet sich nun in Lösung -> Berechnung ergibt die totale Bindungskapazität.
Berechnung:
SAMPLE: Bindungskapazität = (SA2 - SA1) x 252 x 3
BLANK: (C2 - C1) x 252 x 3 BLANK SOLLTE NULL GEBEN!!!
Latente Bindungskapazität kann berechnet werden, indem Serumeisen von totaler Bindungskapazität substrahiert wird.
Prinzip zur Bilirubinbestimmung in Serum? Berechnung?
Im Blut gibt es freies und gebundenes Bilirubin. Freies Bilirubin bindet sofort an Diazoreagens. Damit gebundenes auch bindet, muss es von Albumin getrennt werden (durch Koffein oder Methanol). Färbung kann nun bei 578 nm gemessen werden, woraus die totale Menge des Bilirubins berechnet werden kann.
Berechnungen:
[Bilirubin]total=185 x E
[Bilirubin]frei=246 x E
Für indirektes Bilirubin (gebunden): freies - totales
Prinizp der Cholesterinbestimmung im Blut?
Cholesterin kommt im Blut nur verestert vor. Cholesterol-Esterase spaltet es auf in Cholesterin und freie Fettsäuren. Ist Sauerstoff vorhanden, oxidiert Cholesterol über Cholesterol-Oxidase zu delta4-Cholesterone und H2O2. Peroxid wird von Peroxidase in Präsenz von 3-aminophenazon zu H2o und Quinon-Imin-Komplex abgebaut. Quinon-Imin-Komplex weist rote Färbung auf.
Berechnung: [Cholesterin] = E x 25.1
Prinzip HDL-Cholesterin-Bestimmung?
Mit MgCl2 können LDL und VLDL ausgefällt werden. HDL bleibt an Oberfläche gelöst (da sehr klein). Flüssige Phase mit HDL wird in Mikroküvette gegeben, zusammen mit PAP-Reaktiv. HDL löst sich, reagiert und bildet H2O2. H2O2 kann durch Reduktase zu H2O werden. PAP färbt sich mit H2O rot!
Berechnung: [HDL-Cholesterin] = E x 11.03
Was ist das Prinzip des Faktor V Leiden Mutations Experiments?
In der Elektrophorese werden die DNA-Stücke ihrer Länge nach unterschiedlich weit wandern, was erkennen lässt, ob eine Mutation vorliegt. (Bei Mutation entstehen durch die Restriktionsenzyme nur 2 geschnittene Teile, da durch die Mutation eine spezifische Schnittstelle verloren geht -> 1 längerer Teil)
Prinzip des ELISA Experiments?
Es gibt 2 verschiedene Varianten von ELISA:
- Sandwich: Detektion über Enzym-gekoppelte Antikörper:
- Antikörper (Ab) wird an Trägermittel gebunden, das Antigen (Ag) bindet nun an diesen Ab
- Enzym-gekoppelter Ab bindet nun an das Testantigen
- Umsetzung des Enzymsubstrats: Farbe oder Lumineszenz
- Menge kann nun mit der Standardkurve der bekannten Ag-Menge bestimmt werden
- Kompetitiver ELISA:
- Kompetition zwischen Träger-gebundenes-Antigen und freiem Antigen für eine limitierte Menge an markierten X-Abs
- Bestimmung der Menge des unmarkierten Ags: Standardkurve
Prinzip des SDS-Page Experiments?
Proteine werden durch SDS-Page (Gel-Elektrophorese) getrennt. Dies geschieht aufgrund von Grösse (je grösser desto langsamer) und Ladung (negative Ladung in Richtung positive Anode). Um aus einer Mischung zu erkennen, wie gross die Moleküle sind (und damit auch um welche Moleküle es sich handelt), braucht es eine "Leiter", welche parallel zu der Proteinmischung durch das Gel geschickt wird.
Bei der Leiter handelt es sich um bekannte Proteine mit ebenfalls bekannter Grösse.
