Molekularbio

Amylase: Brauindustrie, biologisches Waschmittel für Stärkeabbau

Trypsin:Babynahrung: baut Proteine ab, erleichtert die Verdauung

Lipasen: biologisches Waschmittle zur Entfernung von Fettflecken  

Bakterielle Gesequenzen sind oft A/T-reicher, als Pflanzengensequenzen. =>Eventuell andere Nutzung synonymer Codons

Die tRNA Konzentration korreliert mit der Häufigkeit der zugehörigen Codons =>Codons mit niedriger tRNAIKonzentration werden unter Umständen langsamer decodiert => ineffiziente Translation => A/T-reiche Sequenzen in den Pflanzen können zur RNAIInstabilität führen.

Polyadenylierungssignale enthalten meist AATAA. RNAIInstabilitätsIDeterminanten sind oft AIreich (z.B. ATTTA)

Erhöhter A/TIGehalt kennzeichnet Pflanzen-Introns; zusammen mit zufällig vorhandenen Splice/Donor und Acceptor/Signalen (AG’GT) kann unerwünschtes Splicing resultieren.  

• Da bakterielle Gene A/T-reich sind: Erhöhung des G/C-Gehaltes durch Anpassung der synonymen Codons (anderes Codon für gleiche Aminosäure)

• Änderung der Codon-Zusammensetzung, um die Translation zu verbessern (unter Berücksichtigung verschiedener tRNA-Konzentrationen in der Zelle)

• andere Promotoren, Enhancerduplikation, Introns (Gene mit Introns werden im Allgemeinen besser exprimiert)  

Bacillus-thuringensis-Toxin ist ein insektizides Protein des Bacillus thuringensis, welches sich im Insektendarm von der passiven in seine aktive Form umwandelt und die Darmwand schädigt.
Bt.Toxin wird also zur Schädlingsbekämpfung verwendet und zusätzlich auch zur Herstellung gentechnisch veränderter Nutzpflanzen. Diese Pflanzen haben das Bt-Gen im Genom integriert, wodurch nur Frassinsekten getötet werden.  

Bei der Chloroplastentransformation werden Transgene ins Chloroplastengenom integriert.

• hohe Expressionsrate, da pro Zelle sehr viele Plastidengenome existieren
• bakterielle Transene sind unmodifiziert verwendbar, da das Expressionssystem der Choroplasten eher prokaryotisch ist (keine Probleme mit zufälligen RNA-Instabilitäten)

überwiegend maternale Vererbung => Auskreuzungsgefahr geringer

-abgeschlossenes Kompartiment => keine toxischen Effekte im Zytoplasma

-genaue Integration  

CaMV = Cauliflower Mosaik Virus
Dies ist ein konstitutiver (=elementarer/wesentlicher) Promoter in der Pflanzengentechnik und funktioniert in vielen Pflanzen. Er ist verantwortlich für die Transkription des Genoms des Blumenkohl-Mosaik-Virus’.
Aufgrund der viralen Herkunft des Promoters ist die Transkription der nachgeschalteten Gene sehr effizient.  

=> Testmethoden für die Anwesenheit eines Gens: 

• Southern Blot : 
  • + weniger fehleranfällig
  • - markierte Gensonde, Gelelektrophorese, Auskunft über die Länge der Fragments 
• RT3PCR mit spezifischen Primern 
  • +rasches Screening, unspezifische PCR3 Amplifikation möglich, keine Auskunft über die Länge des Fragments nötig
  • - fehleranfällig 
•  Restriktionsanalyse: 
  • +keine Hybridisierung nötig
  • - Auskunft über die Länge des Fragments & den Integrationsort nötig, sowie Restriktionsenzyme, aufwendig  
• Sequenzierung 
  • - Auskunft über den Integrationsort,
  • - aufwendig  

=>Testmethoden für die Expression eines Gens: 

• Northern Blot  
  • +gibt Auskunft über Menge & Länge der RNA, Vergleich von RNA verschiedener Zellzuständen möglich
  • - aufwendig, ineffizient 
• Western Blot  
  • - Antikörper nötig  
• RT-PCR  
  • + Quantifizierung durch „real-time“-PCR möglich
  • - Umschreiben von RNA in cDNA  
• ELISA  
  • +Detektion des Proteins
  • - zwei spezifische Antikörper nötig  
• Gen-Chip  
  •  +Bestimmung verschiedener RNA
  • - Spezies gleichzeitig  
• In-situ-Hybridisierung 
  • +gibt Informationen über den Expressionsort
  • -aufwendig, bei schwacher Expression nicht interpretierbar  

Protein: Western Blot  

RNA: Northern Blot 

DNA: Southern Blot  

posttranslationale Protein-Modifikationen:

• Acethylierung,
• Methylierung,
• Phosphorylierung
• Glykosylierung,
• Ubiquitinierung
• Prozessierung/ proteolytische Spaltung
• Disulfidbrücke

Histon Modifikaitonen:

• Acethylierung,
• Methylierung,
• Phosphorylierung
• Ribosylierung

RNA-Modifikation

• Polyadenylierung,
• Splicing,
• Capping 

????

Microarray

Vorteil: innert kurzer Zeit kann man Genome sequenzieren.

Nachteil: kostenspielige Verfahren, Fehleranfälligkeit...  

???

Versuch mit Probanden, oder Test mit Serum von Allergikern, oder Abschätzen aus Erfahrung (Strukturähnlichkeiten mit Allergenen...)