Molekularbio

Vorteile

• effiziente Gentransfermethode
• Organismus, oder Zellen darin können gezielt verändert werden
• starke Genexpression möglich, da hohe Gen-Kopienzahl bei funktionalen Viren flexibel einsetzbar

Nachteile

• Immunantwort in Tieren stimuliert
• integrierende Viren sind mutagen
• Interaktionen mit anderen Viren, oder Pathogenen im Zielorganismus
• mögliche Kontamination aus den Verpackungs-Zelllinien  

Agrobakterien sind Bodenbakterien, die einen Teil eines Plasmids auf Pflanzen übertragen und dort ins Genom integrieren. 

Zweck: Agrobakterien übertragen Gene in die Pflanze, worauf diese Nährstoffe für das Bakterium produziert und Tumore bildet, um einen geeigneten Lebensraum zu gewährleistn.

Weg:

1. Bakterien erkennen phenolische Komponente die von verwundeten Pflanzen produziert werden
2. VirA3Protein als Phenolrezeptor aktiviert VirG
3. VirG induziert Expression von weiteren Virulenz3Genen 
4. Einzelstrangschnitt durch virD2 im Ti-Plasmid (right border)
5. Synthese eines neuen Einzelstrange(dabei wird der alte Strang abgelöst und abgeschnitten am left vorder
6. Transfer des abgelösten Einzelstranges aus dem Bakterium in den Kern der Pflanzenzelle (VirB und andere Proteine bilden dabei einen Transportkanal)
7. Integration in die Planzenzelle erfolgt zufällig
8. Expression neuer Eigenschaften

Vorteil: Effiziente Übertragung und saubere Integration der FremdDNA

Nachteil:Wirsbereich der Agrobakterien und Regenerierbarkeit des infizierbaren Gewebes

Die T-DNA enthält Border-Sequenzen, zwischen denen Gene liegen, welche für die Synthese von Opinen und Proteinen codieren. Die Opine dienen den Bakterien als Nährstoff. 

Insertionsmutagenese: =>für Lokalisation von DNA auf Wirtsgenen

Ein ins Genom integriertes Transgen zerstört das vorhandene Gen. Man hat jedes Gen einzeln durch Insertionsmutation inaktiviert und die Insertionsorte sequenziert. Man findet heraus, welches Gen von der Insertion inaktiviert/zerstört wurde und sequenziert das Genom, sodass man weiß, wo das zerstörte Gen (und damit auch die T-DNA) liegt.
Die T-DNA-Integration ist zufällig: Man kann für alle Gene des Fremdgenoms ermitteln, wo sie liegen.

Promoter/Enhancer--> Traps: =>für Bestimmung der Aktivität der Gene auf der Wirts-DNA

Reportergene mit T-DNA werden in die Zelle eingeführt. Das Transgen auf der T- DNA wird so konstruiert, dass sie nur dann aktiv werden, wenn sie zufällig unter die Kontrolle von zellulären Expressionssignalen, die mit der Insertionsstelle benachbart sind, gerät. Ihre Expression spiegelt somit diejenige des sonst dort vorhandenen Gens. Die Aktivität lässt sich mit Reportergenen visualisieren.

Traps kann man auch folgendermaßen konstruieren: Es wird ein spezieller Transkriptionsfaktor inseriert (wird unter Kontrolle des jeweiligen Genorts exprimiert), der sowohl ein sichtbares Reportergen, als auch beliebigeandere Transgene aktivieren kann.
(Beim Promoter Trap muss das Reportergen in ein Exon integriert werden.)

Mit dem Enhancer-Trap-Verfahren werden transgene Organismen erzeugt, die ein Transgen nur in bestimmten Zellen exprimieren. Dabei ist es nicht nötig die Promotoren für diesen Zelltyp zu kennen. Es wird ein GAL4-Konstrukt in das Genom eingebracht. Springt das Konstrukt zufällig in die Nähe der Enhancerregion, wird sowohl das entsprechende Gen, als auch das GAL4-Gen durch den Enhancer aktiviert.

Da die Spezifität der Genexpression von dem Enhancer abhängen kann, erhält man so verschiedene transgene Linien mit einer GAL4-Expression in verschiedenen Zelllinien.  

Für den T-DNA-Transfer sind Vir-Proteine und Bordersequenzen nötig. Die Region zwischen den Bordersequenzen (transferiertes Gen) kann beliebig verändert werden. Ein Ti-Plasmid ist relativ groß, weshalb man die T-DNA und Vir-Gene auf zwei Plasmide verteilt und damit ein sogenanntes binäres Vektorsystem konstruiert.

Bei diesem System liegen im Bakterium also zwei Plasmide vor. Ein entwaffnetes Ti-Plasmid (sog. „Helfer-Ti-Plasmid“, trägt die vir-Region, T-DNA Region wurde jedoch entfernt). Außerdem ein Plasmid, das in einer T-DNA Region das 'gene of interest' trägt, welches übertragen werden soll. Bei der Infektion löst das Helferplasmit die Assoziation des Bakteriums mit der Pflanzenzelle aus, dann wird die T-FNA des zweiten Plasmids in das Pflanzengenom übertragen.  

Bei den Pflanzenzellen wird die Zellmembran durch Enzymbehandlung (Cellulase, Pectinase...) entfernt. Dadurch entstehen Protoplasten (wie bei Tierzelle nur noch von einer Membran umgeben). In solche Zellen kann man durch Behandlung mit PEG, Elektroporation, oder Liposomen DNA einschleusen.

Diese Methode wird heute weniger zur stabilen, als zur transienten Transformation angewandt.  

PEG: PEG (polyethylene glycol mediated DNA3uptake) reduziert die Löslichkeit der MDNA und perforiert die Membran von Protoplasten und Pollen, sodass die Zellen freie DNA aufnehmen 

Elektroporation: Die Protoplastenmembran wird durch kurze elektrische Impulse perforiert (Ladungstrennung in der Zelle führt zu Membranpotential und damit zur Porenbildung), sodass die Zellen freie DNA aufnehmen  

Liposomen: Liposomen = künstlich erzeugte Vesikel, die DNA aufnehmen können. Die Liposomen werden via Membranfusion, oder Endocytose vom Protoplasten aufgenommen 

Partikelbeschuss: Die Zelle wird von mit DNA beladenen Schwermetallpartikeln beschossen (funktioniert auch bei Zellen mit Zellwand)  

Mikroinjektion: Die DNA wird mit einer Glaskanüle in das Zytoplasma injiziert. 

Für die ersten drei Methoden ist die Erzeugung eines Protoplasten notwendig. Diese Methoden führen meist zu transienter Transformation.   

stabile Transformation Das in die Wirtszelle eingeschleuste Gen ist stabil (bleibt dort, nicht nur kurzfristig)

transiente Transformation: Ein in die Wirtszelle eingeschleustes Gen, welches nur vorübergehend abgelesen wird ist eine nicht-stabile, vorübergehende, also transiente Transformation =nichtintegrierte Transgene  

Bei Pflanzen wird die Transgen-DNA an einen zufälligen Ort integriert (illegitime Rekombination).

Bei Tieren kann man die Integration des Transgens an einen bestimmten Ort durch homologe Rekombination erreichen, indem man das Transgen mit Sequenzen versetzt, welche homolog zum gewünschten Zielort sind 

Alle DNA Transfermethoden schleusen DNA nur in wenige der verfügbaren Zellen ein. Um diese wenigen Zellen gezielt zu vermehren, erfolgt das Zellwachstum nach der Transformation unter Selektion.
Dazu wird ein Transformationsmarker (z.B. ein Antibiotikaresistenzgen, Herbizidresistenzgen...) in die transformierte DNA eingeschleust, dank dem die transformierte Zelle im Gegensatz zu den untransformierten/“normalen“ Zellen unter speziellen Bedingungen wachsen kann.

• Antibiotikaresistenzgen
• Herbizidresistenzgen (Herbizidresistent, oder –tolerant)
• Gene, deren Produkte Nahrung machen können aus dem Substrat, wodurch die transgenen Organismen nicht „verhungern“  

Die Fremd-DNA wird nur von wenigen Zellen integriert. Ein Problem könnte sein, dass die „normalen“ Organismen bei nicht-selektiver Regeneration die transgenen Organismen überwachsen. (Deshalb selektioniert man z.B. indem man ein Milieu schafft, in dem nur die transgenen Organismen überleben können = selektive Regeneration) 

Bei der positiven Selektion werden Gene verwendet, deren Produkte das Überleben des transgenen Organismus ermöglichen, indem die Produkte Substrate (Mannose, Xylose) verfügbar macht, welche als Nahrung für den Organismus dienen. Somit können transgene Organismen auf dem Substrat wachsen, während „normale“ Organismen verhungern. 

Dies geschieht aufgrund von folgenden Effekten:

Positionseffekte: Der Integrationsort beeinflusst die Genexpression positiv, oder negativ.

Beispiel: Hetero3 und Euchromatin

Silencing: Das aktive Gen wird stillgelegt, die heterochromatische Region wird ausgeweitet.

Enhancer: Da die Spezifität der Genexpression von dem Enhancer abhängen kann, erhält man so verschiedene transgene Linien mit einer GAL43Expression in verschiedenen Zelllinien. (vgl. Frage zu Enhancer Trap)  

Prozessierung/ proteolytische Spaltung

• Precursor (Vorläufer des Proteins) wird durch Proteasen geschnitten (z.B. Signalpeptide am C- oder N-Terminus abschneiden).
• Eine Sonderform ist das Protein-Splicing: entfernt gelegene Aminosäureketten werden zusammengelegt. Dabei gibt es das cis-Splicing (ein Stück der Precursors {= Intein} wird herausgelöst) und das trans-Splicing (Inteine zweier verschiedener Precursoren werden abgetrennt und die Aminosäureketten der Proteine verknüpft)

Disulfidbrücken

• kovalente Bindungen zwischen oxidierten Schwefelatomen zweier Cysteine. Die Reduktion der S-Atome löst die Bindung wieder.

Phosphorylierung

• wird von Proteinkinasen unter Verbrauch von ATP katalysiert und verändert die Eigenschaften und Funktion von Proteinen.

Glykosylierung

• Zuckermoleküle werden an Aminosäuren des Proteins angehängt, wodurch die Faltung und Stabilität des Proteins beeinflusst wird und es geschützt ist vor Abbau

Ubiquitinierung

• Ubiquitinreste werden auf Lysinketten übertragen. Dabei wird die Funktion, oder auch die Lokalisation von Proteinen innerhalb der Zelle verändert.

(Acethylierung) (Methylierung)  

Posttranslationale Modifikationen haben einen Einfluss auf die Eigenschaften eines Proteins:

• veränderte Proteinoberfläche und –struktur
• andere Interaktionspartner,
• Enzymaktivität,
• Proteinstabilität,
• Lokalisation in der Zelle.
• Zelluläre Signalprozesse bauen häufig auf die Veränderung der beteiligten Proteine.

Beispiele:

• Extrazelluläre Stresssignale phosphorylieren aktivieren Kinasen oder Acetyltransferasen, die den Tumorsuppresor p53 phosphoriliren oder acetylieren. Dies führt zu einer Stabilisierung und aktivierung des Proteins --> wird in Zellkern transportiert--> binden an Promoterregionen und führt zu Expressionen von Genen. wird p53 nicht mehr gebrauch wird dessen Abbau durch Ubiquitinierung signalisiert.

• Phosphorylierungskaskaden/Signalkaskaden: Weiterleitung von Informationen

• Histonmodifikation: hat Einfluss auf das Chromatingerüst --> Einfluss auf Genregulation 

• Enzyme sind katalysatorische Proteine, welche chemische Reaktionen beschleunigen.
• Sie setzen die Aktivierungsenergie herab, indem sie Übergangszustände stabilisieren.
• Enzyme besitzen eine hohe Substrat- und Reaktionsspezifität.

=>Michaelis-Menthen:

• Michaelis-Menthen-Konstante (KM) = Substratkonzentration bei der die halbe maximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht wird {wenn klein, dann hohe} Affinität des Enzyms gegenüber seinem Substrat
• Reaktionsgeschwindigkeit (kcat): wie viele Moleküle pro Sekunde durch das Enzym umgesetzt werden
• KM und kcat geben Aussage über die Effizienz eines Enzyms. 

Kleiner KM3Wert bedeutet hohe Affinität. Enzym 1 hat eine höhere Affinität.  

Proteom = Gesamtheit aller Proteine in einem Lebewesen, einem Gewebe oder einer Zelle unter exakt definierten Bedingungen zu einem bestimmten Zeitpunkt 

Die Kenntnis darüber welche Proteine (und wie viele) zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle vorhanden sind gibt Aussage über den Zustand der Zelle, deren Funktion...

Das Genom bleibt konstant, das Proteom hingegen ist sehr dynamisch (Beispiel: Proteom einer Raupe ≠ Proteom eines Schmetterlings)

Das funktionale Genom besteht aus:

• Genom (DNA)              Einfluss auf Regulierung der Transkription
• Transkriptom (RNA)     Einfluss auf Regulierung der Translation
• Proteom (Proteine)      Einfluss auf Proteinstabilität, -modifikation, -aktivität
• Metabolom (Metabolite, Stoffwechselprodukte, ±gesamter Zellinhalt)

Western Blot:

1. Proteinextrakt herstellen mit nativen oder denaturierendem Puffer
2. Auftrennenvon Proteinen
   • Gelelektrophorese: Strom fliest durch das Gel, geladene Proteine wandern im eF und kleine wandern schneller da sie weniger gehindert werden
   • Isoelektrisches Fokusierung: Proteine ordnen sich im ph-Gradient je nach Ladung an
3. Blotting: Proteine auf ein eine Protein-bindende Membran übertragen
4. Nachweisreaktion mithilfe 2 Antikörper
   1. Antikörper bindet spezifisch ans Proteinauf der Membran
   2. Antikörper binden an primären Antikörper, dieser trägt Enzym. Wenn dieses Enzym ein Substrat umsetzt wird Licht erzeugt --> Auflegen eines Filmes --> Belichtung wird nach entwicklung sichtbar

ELISA (enzyme linked immunosorbent assay):

•  erster und zweiter Antikörper: wie bei western blot
• für den Nachweis: Substrat zugeben, welches durch das antikörpergebundene Enzym umgesetzt wird, wodurch ein Farbstoff entsteht.

Massenspektrometrie:

Aufbau

• Ionenquelle --> ionisierte Peptide und bringt sie in die Gasphase
• Massenanalysator --> trennt Peptide nach ihrere Masse auf
• Detektor --> Erfassung der separaten Peptide

Spektren auswerten

• Jeder Peak entspricht einem Peptid (charakteristische Massen/Ladungs -Verhältniss
• Anhand der gemessen Peptidmassen wird das am Besten passende Protein aud der Datenbank ermittelt durch einen Suchalgorithmus

Immunopräzipitation:
Mit Antikörpern beladene Kügelchen werden in ein Zellextrakt gegeben und binden spezifisch an das zu untersuchende Protein. Die Lösung wird auf eine Matrix gegeben, an die nur die Antikörper binden. Danach Waschvorgang; übrig bleiben an Matrix gebundene Antikörper mit dem gewünschten Protein dran. " schnell und unkompliziert, aber nicht in lebenden Zellen

Hefe Dihybrid@System (Y2H):

• basiert auf dem Hefe Transkriptionsfaktor FAL4
• GAL4 besteht aus einer Bindenden und einer aktivierender Domäne
• zu testende Proteine werden mit GAL-BD oder GAL-AD fusioniert
• in Hefen-DNA: GAL-Bindestelle und nachfolgendes Reportergen

Interaktion zwischen A und C --> Reporter aktiv --> Hefe-Kolonie blau (Reportergen LacZ)
keine Interaktion: zwischen A und B --> Reportergen inaktiv --> Hefe-Kolonie weiss

• " in lebenden eukaryotischen Zellen,
• Probleme
  • die Interaktion muss möglich sein,
  • unspezifische Interaktionen (falsch positiv), obwohl die Proteine in natürlicher Umgebung nicht mit einander interagieren würden  
  • Autoaktivierung (aktives Reportergen ohne Interaktionspartner)

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)

• Ein angeregtes fluoreszierendes Protein sendet Photonen aus--> nahes Protein wird angeregt

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

• Yellow Fluorescent Protein (YFP) wird in N- und C- Terminus unterteilt
• zu testende Proteine werden mit N- und C-Terminus fusioniert
• Expression der Fusionsproteine
• Interaktion der Proteine --> N- und C- Terminus kommen in räumliche Nähe --> bilden funktionsfähiges YPF
• kann Fluoreeszentmikroskopisch nachgwiesen werden

Zellkern:

• Transkription (DNA3-->prä-mRNA)
•   Prozessierung (prä-mRNA3-->mRNA)
•   mRNA vom Zellkern ins Zytoplasma

Zytoplasma:

• Translation (mRNA3-->Protein) durch Ribosom
• Protein (nicht, oder nur teilweise gefaltet) erhält zielorganell-spezifische
• Signalsequenz (um die Membrane der Chloroplasten zu durchqueren)

Durchquerung der Membranen: (in ungefaltetem Zustand)

•   TOC-Proteinkomplex: Transport über äußere Membran
•   TIC-Proteinkomplex: Transport über innere Membran

Im Chloroplasten:

• Proteine werden anhand ihrer Signalpeptide verteilt (ins Stroma, in die innere Hülle, oder in die Thylakoiden)

Transport durch die Thylakoidmembran:

•   Sec Transportweg (ATP-abhängig)
•   Tat Transportweg (pH-Gradient-abhängig)
•   SRP Transportweg (GTP-abhängig)  

=>Transport zum Mitochondrium:

• Zellkern & Zytoplasma: vgl. oben Durchquerung der Membranen:
•   TOM3Proteinkomplex
•   TIM3Proteinkomplex
• Der Transport ins Mitochondrium erfolgt in entfaltetem Zustand: Chaperone außerhalb und innerhalb der Membran. N-terminales Transpeptidende wird nach dem Transport entfernt.

=>Peroxisome

• ...enthalten keine eigene DNA und importieren somit Proteine
• Ein Rezeptorprotein bindet an die Signasequenz PTS1 am für Peroxisome bestimmten Protein und führt es an die Oberfläche des Peroxisoms. Die Proteine werden hier in gefaltetem Zustand hineintransportiert.
   

=>Vesikeltransport: Abschnüren vom Vesikel im ER, Transport durch den Golgi-Apparat

• (von cis nach trans), Abschnürung vom Golgi-Apparat, Transport zur Plasmamembran
• Endocytose (Aufnahme) und Exocytose (Abgabe) können konstitutiv (ungesteuert), oder rezeptorvermittelt sein.  

=>Transport via ER und Golgiapparat:

• ER: 
  • co-translationaler Proteintransport am rauen ER (wird ins ER translatiert) Protein wird im ER modifiziert und korrekt gefaltet durch Chaperone
  • korrekt Prozessierte Proteine verlassen das ER durch Vesikeltransport
• Golgiapparat:
  • nimmt Vesikel mit Proteinen am CGN (cis-Golgi-Netzwerk) auf, modifiziert sie und entlässt sie am TGN (trans-Golgi-Netzwerk)

=>Transport in den Zellkern:

• verläuft über Kernporenkomplex
• Import: Histone, DNA/RNA3Polymerasen, Transkriptionsfaktoren, RNA3 prozessierende Proteine
• Export: t3RNA, mRNA via: Kernporen3Komplex, Exportine und GTPasen, Proteine eine Erkennungssequenz  

charakteristische Proteine: Proteine für rauhes ER und glattes ER, für Golgi-Apparat, Lysosomen, Endosomen, Membranproteine, Sekretproteine

Das raue ER ist mit Ribosomen besetzt.

 Modifikationen: Korrekte Faltung mit Hilfe von Chaperonen, Glykosylierung, spezifische proteoöytische Spaltung, Assemblierung zu Proteinkomplexen, Disulfidbrücken... ...Disulfidbrücken entstehen in oxidierendem Milieu. (Schwefelatome werden oxidiert; Reduktion löst die Disulfidbrücke wieder.)

Redox-Puffer: Glutathion (GSH), reduziert ! Glutathion3Disulfid (GSSG), oxidiert

(Tripeptid u.A. aus Cystein) 

• fertiges Protein wird in ein cis-Golgi-Vesikel verpackt
• geht durch die Golgi-Subkompartimente: CGN-->cis3, medial-, trans- Golgi-Stapel-->TGN, dabei werden die Proteine z.T. noch modifiziert
• Vesikel verlässt den Golgiapparat, die Proteine werden durch Exozytose in den extrazellulären Raum abgegeben 

Clathrin ist ein Protein, welches bei der Bildung von Vesikeln und der Einstülpung von Zellmembran beteiligt wird. Durch die Clathrin3Bindung krümmt sich die Membran und entwickelt sich dann zu einem Vesikel. 

• Uniformität: Kreuzung zweier homozygoter Eltern ergibt lauter gleiche Nachkommen (F1-Generation)

• Aufspaltung: In der F2 Generation spalten die Merkmale nach bestimmten Regeln auf (Allele für die Merkmale werden einzeln auf die Gameten verteilt).

• Merkmale werden unabhängig von einander vererbt. => Gene auf dem gleichen Chromosom sollten gekoppelt sein.