Molekularbio

Kurz: Ein DNA-Chip, oder Microarray ist ein Trägerelement mit DNA-Sonden für den Nachweis von Nukleinsäuren und beruht auf dem Prinzip der Hybridisierung.
Microarrays werden verwendet, um bekannte Gene zu identifizieren und deren Aktivität zu messen, sie bestimmen also die relative Änderung der Genexpression.

Die einzelnen Felder des Microarrays sind mit einzelsträngigen DNA-Stücken besetzt. Die mit rotem und
grünem Fluoreszenzfarbstoff markierten mRNA aus der Testprobe können bei komplementärer Basenabfolge an die DNA auf dem Chip binden.

Die Position, Wellenlänge und Intensität der entstehenden Mischfarbe wird mit einer Laserkamera detektiert, was Informationen über Unterschiede in der Expression der Gene zwischen verschiedenen Proben liefert. Anwendung in Forschung und Medizin:

• Entwicklung von Biomarkern
• Genomtypisierung: Bestimmung von Arten und Individuen
• Screening für bestimmte Krankheitsanfälligkeiten
• (Medikamentenentwicklung und –Sicherheit, Exposition und Reaktion auf Medikamente und Umweltgifte)
• Klassifizierung von...Tumortypen, antibakterielle Substanzen
• Diagnostik: Zeitgewinn in der klinischen Mikrobiologie
• Analyse der Wirkungsprinzipien von Medikamenten und Umweltgiften 

1) Capping: Am 5’Ende der RNA, cotranskriptionell eine modifizierte Form des Guonasins durch das Capping-Enzym angehängt.

• RNA-Stabilisierung
• Struktur dient als Signal zur Bindung der kleinen ribosomalen UE zu Beginn der Translation

2) Polyadenylierung: PolyA-Komplex erkennt PolyA-Signal auf mRNA. Die prä-mRNA wird geschnitten, die PolyA-Polymerasen verlängern das 3’Ende mit 100- 200 Adenosin-Resten.

• RNA-Stabilisierung
• unterstützt Export der fertigen mRNA ins Zytoplasma

3) Splicing: Introns werden aus der prä-mRNA herausgeschnitten, Exons bleiben übrig. Der Vorgang wird durch Spliceosome katalysiert und ist eine Transesterifizierung. Es gibt auch autokatalytisches Splicing, d.h. ohne Spliceosome, alternatives Splicing und trans-Splicing.

• Codierende Gene bleiben übrig. Je nachdem wie geschnitten wird, bleiben jene codierende Regionen übrig, die man exprimiert haben möchte. 

Dank alternativem Splicing können aus einer prä-mRNA mehrere mRNAs gemacht werden durch Entfernung von Exons (Exon Skipping), Beibehalten von Introns (Intron Retention), oder durch Benützung alternativer Splicestellen (Splice Site Alteration). So kann aus einer prä-mRNA eine große Anzahl an mRNAs und Proteine erzeugt werden. 

Wenn aus verschiedenen prä-mRNAs eine mRNA gemacht wird. (hauptsächlich in Chloroplasten und Mitochondrien) 

CAP
5’UTR
ORF (Protein-kodierende Region) 3’UTR
PolyA Region 

Mechanismus:

• Polyadenylierungs-Komplex erkennt Poly(A)-Signal auf prä-RNA
• Endonukleasen schneiden mRNA
• 100 bis 250 Adenosin Reste werden von der poly(A)-Polymerase darangehängt
• poly(A) binding Protein stabilisiert und beschleunigt

Prokaryoten: Polyadenylierung als Signal für den Abbau von mRNA
Eukaryoten: Schutz der präRNA vor Abbau durch 3'Exonucleasen, Unterstützt Export der fertigen mRNA ins Cytoplasma, Stimuliert Translation

Weitere RNA-Prozessierungsschritte: Splicing, Capping 

Sie tragen keine Information zur Herstellung eines Proteins, aber sie haben eine regulatorische Funktion für die

• RNA-Stabilität,
• Translationsinitiation
• Translationsgeschwindigkeit. 

Die Translation (Erzeugung eines Proteins durch Ablesen der mRNA) findet im Zytoplasma statt. Daran beteiligt sind:

tRNA

• stellt Aminosäuren bereit, enthält ein Anticodon spezifisch für die Codons der mRNA
• codierende Aminosäure jeweils am 3’Ende
• kleeblattförmige Sekundärstruktur, es gibt 2 tRNAs die Methionin tragen (eine nur für die Initiation der Translation, eine für die wachsende Peptidkette)

Ribosomen

• bestehen aus einer großen und einer kleinen Untereinheit, die aus rRNAs und Proteinen bestehen
• Ribosomen und UEs werden nach ihrem Sedimentationsverhalten aufgeteilt

Weiterhin benötigt werden:

• zu translatierende mRNA 
• Aminosäuren 

A) Initiation: Zusammensetzung der Translationsmaschinerie am Startkodon

• (Scanning) kleine ribosomale Untereinheit (UE) bindet am 5'-Cap und wandert entlang der RNA bis zu einem Startkodon
• Grosse UE bindet und die Translation kann beginnen

B) Termination: Erreichen eines Stopcodons

• Release-Faktoren (RF) werden in den ribosomalen Kontext aufgenommen
• Unter Hydrolyse von GTP wird die Aminosäure von der tRNA in der P-Stelle des Ribosoms abgelöst
• Freisetzung der Peptidkette und Trennen der UE des Ribosoms

Das Startcodon ist immer AUG (für Methionin).
Es existieren zwei verschiedene tRNAs, welche das Methionin tragen. Das eine ist speziell für den Start der Translation (dieser bindet an den Komplex aus mRNA und der kleinen UE, danach bindet die große UE). Der andere ist für den Einbau von Methionin in die wachsende Polypeptidkette.
Schritte der Translation-Elongation:

• Codonerkennung

• Peptidbindung

• Translokation

tRNA mit Aminosäure bindet mit dem Antikodon an A-Stelle Peptidbindung zw. den Aminosäuren an der A- und P-Stelle tRNA bewegt sich um ein Triplet auf der mRNA Richtung 3’Ende, verlässt Ribosom an der E-Stelle

Der erste und der dritte Schritt sind dabei energieabhängig. Prokaryoten: fMet-tRNAi (Initiation), Met-tRNA (Elongation) Eukaryoten: Met-tRNAi (Initiation), Met-tRNA (Elongation) 

• Position A: Aminoacyl- oder Erkennungsstelle
  o tRNA bindet durch Interaktion von Antikodon (tRNA) und Kodon (mRNA)

• Position P: Peptidyl- oder Bindungsstelle
  o neue Aminosäure wird mit der wachsenden Peptidkette verknüpft

• Position E: Exitstelle
  o entladene tRNA verlässt das Ribosom 

1. Ein Kodon ist ein Basentriplett, also eine Abfolge von drei Nucleotiden. Immer drei Nucleotide (also ein Codon, oder Triplett) steht für eine Aminosäure (von möglichen 20), oder für ein Start- oder Stopp-Signal. Es können mehrere Codons für die gleiche Aminosäure codieren. Insgesamt gibt es 64 mögliche Basentriplets aus den Nukleinsäuren A, T, G und C. 

Durch die Sekundärstruktur, vor allem Loops und doppelsträngige Bereiche, kann die Menge an Protein, die von einem mRNA-Molekül hergestellt wird, reguliert werden. Faktoren, die beeinflusst werden sind:

• Zugänglichkeit der mRNA für Translationskomplexe
• Ablauf des Scannings
• Bildung interner Bindungssignale (zusätzliche ORFs der mRNA können translatiert werden)
• Blockierung der Elongation (Folge: frame-shift, wodurch andere Proteinvarianten synthetisiert werden können)
• Die Einflüsse können jeweils zur Initiation und Förderung, aber auch zur Inhibition, Hemmung einer Proteinsynthese führen. 

NMD ist ein Kontrollmechanismus und wirkt fehlerhafter mRNA entgegen. Diese Fehler können durch falsches Splicing, frame-shifts, oder Mutationen entstanden sein.
Die Exons der zu translatierenden mRNA besitzen EJCs (exon junction complex), welche signalisieren, dass sie ein Exon sind. Diese Komplexe werden beim ersten Ablesen der mRNA entfernt. Ist die mRNA fehlerhaft (z.B. Stop-codon vor noch weiteren Exons und EJCs), dissoziiert sich das Ribosom, die Translation hört zu früh auf, wodurch auch nicht alle Komplexe auf den Exons entfernt werden können und die mRNA wird abgebaut. 

ORF: open reading frame = Protein kodierende Regionen

• beginnt mit Startkodon (meist AUG)
• Endet mit Stopkodon (meist UUA, UAG, UGA)

UTRs: untranslatet Region

• bestitzen regulatorische Funktionen
• sekundäre Faltstrukturen
• Beeinflussen die mRNA Stabilität, Translationsinitiation und Translationsgeschwindigkeit

Kodon:

• enthält die Aminosäuressequenz
• besteht aus 3 aufeinanderfolgende Basen (Triplett Code)

3 Prozesse: Veränderung durch Transposons, Rekombination, Replikation 

2 Substanzen/äußere Einflüsse: elektromagnetische Strahlung, Hitze, polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe (nucleophile Ringöffnungsreaktion mit der DNA)

Veränderungen: Punktmutation, Insertion, Deletion
Punktmutationen haben nur im codierenden Bereich eine Wirkung, sie ändern die Primärstruktur eines Proteins. Insertionen und Deletionen führen zu einer Verschiebung des Leserasters. 

Genome unterscheiden sich am stärksten in nicht-kodierenden Bereichen (Introns).
Es gibt große Unterschieden in internen Regionen und Introns (unterscheiden sich durch die Länge der Introns). Zudem unterscheiden sie sich in der Anzahl und Länge der Transposons und in der 

Das Enzym Reverse Transkriptase synthetisiert cDNA aus prozessierter mRNA. Die cDNA enthält keine Introns, Promoter, oder andere regulatorischen Elemente. Anhand der cDNA kann eine Aminosäurensequenz eindeutig abgeleitet werden und ein cDNA-

Klon zur Expression dieses Proteins genutzt werden. Zudem gibt die cDNA Informationen zum alternativen Splicing. Sie kann für Expressionsanalysen verwendet werden, da sie aus mRNA entstanden ist. (Häufig exprimierte Gene->mehr mRNA->mehr cDNA)

=>cDNA eines Zeitpunktes der Zelle entspricht der Gesamtheit aller exprimierten Gene =>DNA entspricht der Gesamtheit aller vorhandenen Gene
EST = expressed sequence tags, Sequenz translatierter DNA 

Ein Transkript ist ein RNA-Molekül, welches aus der Vorlage einer DNA-Sequenz synthetisiert wurde. (z.B.: mRNA, tRNA, rRNA) Alle Transkripte sind linear und bilden Sekundärstrukturen aus. (wichtig für die Bindung von Proteinen an die RNA, Effizienz der Translation, RNA-Stabilität, Aktivität, falls enzymatisch aktiv) 

Unterschiede von Prokaryoten, Organellen zu Eukaryoten

• Unmodizierte Enden /  Modifizierte Enden
• Poly A Schwanz kodiert für Abbau / 5'Cap, 3'Poly A Schwanz als Schutz
• Polycistronisch (>1ORF): / Monocistronisch  
• Kein Splicing / Splicing  

Prokaryoten: RNA Pol und sigmaFaktor binden an Promoter. Der sigmaFaktor verlässt den Komplex bei einer Konformationsänderung und RNA Pol fängt an zu transkribieren. Einfache Termination: mRNA am nicht-kodierenden 3’Ende macht hairpin-Struktur, welche Transkriptionsmaschinerie an ihrer Arbeit hindert (mech. Stress, Trennung) Rho-abhängige Termination: Rho-Protein erkennt die Terminatorsequenz, bindet an RNA , verfolgt die Polymerase und löst den Transkriptionskomplex auf (bääm) 

Initation: sigma Faktor bindet am Promoter

Elonngation: RNA-Synthese durch RNA Pol in 5’->3’    

Termination: Transkription wird gestoppt, RNA Pol löst sich ab    

Eukaryoten: Promoter enthalten eine TATA-Box, an welche die RNA Pol und weitere Transkriptionsfaktoren binden. Die RNA Pol wird durch Phosphorylierung aktiviert. 

Initiation:Initiationskomplex bindet an Promoter 

Elongation:RNA-Synthese durch RNA Pol in 5’->3’ 

Prozessierung:  Primärtranskript (RNA) =>Capping, Termination,Polyadenylierung, Splicing =>mRNA 

Termination: Transkription wird gestoppt, RNA Pol löst sich ab 

Protein Faktoren werden von der Polymerase zu den Signalen gebracht. Zuerst wird die prä-mRNA geschnitten und das 3' Ende bekommt eine polyAdenylierung. Die Polymerase Dissoziert oder synthetisiert weitere RNA. 

Alternativlösung (je nachdem wie man die Frage versteht):

In Eukaryonten werden die meisten RNAs nach der Synthese durch Prozessierungschritte modifiziert (5‘ capping, splicing, 3‘ Polyadenylierung)
3’Ende: Polyadenylierung: post-transkriptionale Modifikation: Anhängen von A- Nukleotiden an das 3’Ende der prä-mRNA, dient zur Erhöhung der Stabilität und Translatierbarkeit und zum Schutz der mRNA vor Abbau durch 3’-Exonucleasen

5’Ende: Capping: post- (eigentlich co-)transkriptionelle Modifikation: modifiziertes G- Nukleotid, welches an 5’Ende geknüpft wird, erhöht Stabilität und ist wichtig für den Transport der RNA aus dem Kern ins Zytoplasma. 

mRNA (messenger-RNA):produziert durch mRNA durch RNA Pol II, codiert für Proteine tRNA (transfer-RNA): produziert durch RNA Pol III, vermittelt bei Translation richtige Aminosäure zu richtigem Codon auf der mRNA
rRNA (ribosomal-RNA): produziert durch RNA Pol I, Bestandteil von Ribosom

siRNA (small interfering-RNA): produziert durch RNA Pol IV, Bedeutung bei RNAi 

positive Kontrolle: Grundzustand ist „AUS“. Kontrolle bewirkt Anschalten der Transkription --> Aktivator verbessert die Bindung und Transkriptionsinitiation der RNA Polymerase an einem schwachen Promoter. 
negative Kontrolle: Grundzustand ist „AN“. Kontrolle bewirkt Abschalten der Expression. --> Respressor verringert die Bindung und Transkriptionsinitiation der RNA Polymerase an einem Promoter

Repression: Trp bindet an einen Repressor, wodurch dessen Struktur sich ändert und er an die DNA binden kann=>keine Synthese mehr (negative Kontrolle)
Trp: cis-aktiver Operator mit Bindungsstelle für Repressor (ist Tryptophan da, wird die Transkription gestoppt) Operon wird von Endprodukt reprimiert. 

wenn keine Lactose vorhanden: Repressor bindet an Operator, =>keine Synthese
wenn Lactose vorhanden: Lactose bindet an Repressor, der dadurch nicht an Operator binden kann=>Synthese von Proteinen (die z.B. Lactose abbauen) (positive Kontrolle) negative Regulation weil wenn etwas an die DNA bindet lauft nix mehr
Das lac-Operon wird sowohl negativ durch einen Repressor, als auch positiv durch einen Aktivator reguliert. 

Anwesenheit von Lactose: Repressort bindet Lactose, Reduktion der Bindung am Operator --> RNA Synthese möglich. Synthese läuft nur bei wirklichem Mangel: cAMP bindet an CAP --> Komplex bindet an DNA und stimuliert die Transkription
Anwesenheit von Lactose und Glucose:
Glucoseverwertung ist effizienter, als Lactoseverwertung. Anwesenheit von Glucose führt zu niedrigen cAMP Konzentrationen. CAP (grün) bindet lac Operon nicht => Katabolitrepression
kaum Bindung von Lac an Operator, kaum RNA-Synthese, kaum Proteinsynthese 

Promoter – 5’UTR – kodierender Bereich – 3’UTR – Terminator –Enhancer

Promoter: DNA-Abschnitt am 5’-Ende, reguliert Expression des Gens durch Bindung von allg. und spez. Transkriptionsfaktoren (mit deren Hilfe z.B. die RNA Polymerase bindet)

kodierender Bereich: = Exon: DNA-Sequenz die fürs Protein codiert, wird in mRNA umgewandelt 

Terminator: hier hört die Transkription auf

Enhancer: Bei der Bindung eines Aktivatorproteins erleichtert ein Enhancer die Anlagerung des Transktiptionskomplexes

UTR: = Intron: DNA-Sequenzen vor und nach der kodierenden DNA, werden transkribiert, aber nicht translatiert (für Stabilität von mRNA, Regulation von Translationsinitiation und Translationsgeschwindigkeit) 

Beides sind Kontrollelemente
cis-aktiver Faktor: wirkt nur auf ein direkt damit assoziiertes Gen, z.B. DNA-Sequenzen, die regulatorische Proteine binden (Operatoren, Enhancer)
trans-aktiver Faktor: wirkt auf verschiedene unabhängige Gene, z.B. regulatorische Proteine (Aktivatoren, Repressoren, Koaktivatoren, Korepressoren) 

Es werden nicht zu jeder Zeit alle Proteine benötigt. Durch die Regulation wird die Verschwendung von Ressourcen und Energie in der Zelle verhindert. Es ist effizienter nur die Proteine zu bilden, die gebraucht werden. Zudem ist die Zelle schnell reaktionsfähig auf Umweltveränderungen.