Molekularbio

Mutagene sind äußere Einwirkungen, welche die Veränderung des Erbguts verursachen. Sie können Basen chemisch verändern, oder an sie binden und somit die DNA-Struktur verändern. Dadurch haben sie Einfluss auf die Replikation, Rekombination und Expression.

• Punktmutationen haben nur im codierenden Bereich eine Wirkung, sie ändern die Primärstruktur eines Proteins.
  • Insertionen und Deletionen führen zu einer Verschiebung des Leserasters.
• physikalische Mutagene: elektromagnetische Strahlung, Hitze, pH
• chemische Mutagene: Basenanaloge, Basenmodifikatoren, Alkohol, Radikale, aktiver O2 

Genverknüpfung = alle Gene auf einem Chromosom werden mit einander vererbt.

• Crossing Over: Wenn zwei doppelsträngige DNA-Moleküle mit ähnlichen Nukleotid-Sequenzen nahe beieinander sind, können DNA-Abschnitte zwischen den beiden gepaarten Molekülen ausgetauscht werden. 

Transposons sind bewegliche DNA-Elemente („selfish DNA“).

• Sie springen zwischen Genomregionen (inverted repeat transposon),
• produzieren neue Kopien, welche an anderen Orten integrieren (retro transposons).

Sie können ein Gen deaktivieren, indem sie mitten in den kodierenden Bereich springen. Das Gen wird wieder aktiviert, indem das Transposon aus dessen Mitte entfernt wird. Beim Ausschneiden bleibt eine Sequenz zurück (footprint).

Transposons können durch Stress induziert werden. 

Retrotransposons sind transponierbare DNA-Sequenzen, deren Struktur ähnlich der von Retroviren ist. Die sind also Retroviren ohne extrazelluläre Phase. Ihre integrierte DNA kann in eine „genomische“ RNA transkribiert werden (d.h. RNA als Zwischenstufe), welche wiederum durch Reverse Transkriptase in ein DNA-Molekül umgeschrieben wird, wobei durch die Nutzung des Repeats am Ende gleich noch der Promoter angehängt wird, der ja von dem RNA-Molekül sein muss. Dann wird dieses DNA-Molekül an einem neuen Ort im Genom integriert. 

• Aktivität der Gene in der Umgebung erhöhen oder senken,
• die Gewebespezifität ändern 
• alternatives Spleißen neue Genprodukte hervorbringen

grosser Beitrag zur Genetischen Variabilität

Retrotransposons sind genauso (irgendwo) im Genom integriert, wie Transposons. Je nachdem, ob sie sich zufällig gerade mitten in ein Gen hineinpflanzen, können sie somit das entsprechende Gen inaktivieren. Dieses Gen ist dann erst wieder aktiv, wenn das Retrotransposon weg ist. Je nachdem wo das Retrotransposon im Genom ist, kann es auch die Genomstruktur und damit die Genexpression beeinflussen. 

Inverted Repeat Transposon

• cut&paste („springen“)
• Enzym Transposase
• Ortswechsel ohne Zwischenstufe
• flankiert durch inverted repeats
• selten

Retrotransposon:

• copy&paste („vermehren“)
• Enzym Reverse Transkriptase
• Ortswechsel mit RNA
• Zwischenstufe
• flankiert durch long term repeats
• häufig 

Homologe Rekombination:

• -kontrolliert und zwischen zwei sehr ähnlichen Segmenten (homolog)
• -Ausbildung einer Zwischenstufe (holiday structure)
• -Austausch von DNA-Abschnitten zwischen gepaarten DNA-Molekülen -für Reparatur größerer Schäden und DNA-Doppelstrangbrüchen
• -gezielter Einbau fremder Sequenzen an Genomorte, homolog zur Fremdsequenz 

Illegitime Rekombination (= nicht-homologe Rekombination):

• -wenn die Abschnitte keine Homologie aufweisen
• -zufällige Verknüpfung/Austausch von DNA-Abschnitten 

Homologe Rekombination findet zwischen DNA-Stücken statt, die über lange Strecken ähnlich, oder identisch sind. Dabei entstehen Zwischenstrukturen (holiday structures) welche dann zu Neukombinationen verschiedener Regionen (der homologen Chromosomen) vor und hinter der eigentlichen Rekombinationsstelle führen.

Genkonversion: Falls die rekombinierenden DNA-Stücke nicht identisch sind, entsteht eine imperfekte Basenpaarung, wobei bei der Reparatur ein Allel verloren gehen kann. Ein Beispiel dafür ist „Mating Type Switching“

Mit homologer Rekombination können DNA-Doppelstrangbrüche repariert werden. 

Punktmutationen führen zu sogenannten SNPs (Single Nucleotid Polymorphism). (stille Mutation, Veränderung der Kodierung: premature stop, oder frame shift)

Insertion und Deletion von DNA-Abschnitten führen zu sogenannten Indels.

Mutationen können sowohl Fehlfunktionen, als auch Variabilität generieren, oder keine Effekte zeigen.

In der Forschung wird die genetische Variabilität genutzt um Phänotypen zu entdecken (forward Genetics), oder Funktionen eines Gens zu erschließen, wenn andere Gene defekt sind (reverse Genetics). Die Mutation wird durch Bestrahlung hervorgerufen, oder mit Chemikalien. 

-Pseudogenisierung: Verlust der Expression

-(spezifisches) Silencing: eine Kopie wird (teilweise) abgeschaltet

-Subfunktionalisierung: Regulatorisch (jede Kopie wirkt in anderem Kontext), Kodierend (Kopien haben Teilfunktionen eines ursprünglich multifunktionalen Gens)

-Neofunktionalisierung: Regulatorisch (Funktion in neuem Kontext), Kodierend (neue Funktion durch Mutation) 

Transkription, RNA-Prozessierung, mRNA-Transport, mRNA-Translation, mRNA- Degradation, Protein-Degradation 

• Mutagenese: künstliche Mutanten durch radioaktive Bestrahlung, oder Gewebestrukturbehandlung erzeugen
• mögliche Anzahl Kreuzungspartner erhöhen (Überwindung der Artengrenze)
• Embryo-Rescue (nicht-überlebensfähigen Keimling „durchbringen“) ->Protoplastenfusion (Pflanzenzellen verschiedener Arten fusionieren) 

biologische Voraussetzung: ein funktionierendes Gen

technische Voraussetzungen: Methoden, wie man...

• ...dieses Gen in den Zielorganismus bringt
• ...Vorhandensein und Funktion des Gens im fremden Organismen testet
• ...aus einer transgenen Zelle einen transgenen Organismus macht (ev. reicht auch nur die Vermehrung transgenen Zelle) 

Transformation durch Agrobakterien (Bodenbakterien, z.B. Agrobacterium tumefaciens)

Transformation durch Viren: schleusen ihre eigene DNA in die Zelle anderer Organismen. Diese DNA baut sich entweder in die DNA der befallenen Zelle ein, wodurch die Information auf der Viren-DNA abgelesen und exprimiert wird. Dadurch entsteht ein Haufen neuer Viren. Oder XXX

Agrobacterien: übertragen einen Teil ihres Plasmids auf Pflanzen und integrieren es in deren Genom.  

• DNA bindet die Base Thymin und RNA bindet die Base Uracil.
• Da die DNA die OH-Gruppe am C2-Atom nicht hat ist sie viel stabiler, als die RNA.
• Da die DNA in doppelsträngiger α-Helix-Form vorkommt, muss sie erst entwindet und die beiden Stränge getrennt werden, damit sie abgelesen werden, oder repliziert werden kann. Die RNA kommt in der Regel einzelsträngig vor und kann somit sofort von einem Ribosom translatiert werden.
• DNA wird im Zellkern transkribiert, RNA wird im Zytoplasma translatiert.
• Die DNA ist ein recht großes Molekül und verlässt deshalb den Zellkern nicht. Die RNA hingegen ist viel kleiner und kann den Zellkern verlassen um transkribiert zu werden. 

DNA: enthält die gesamte Erbinformation und codiert für die von der Zelle, oder vom Organismus benötigten Proteine
 

RNA: Es gibt verschiedene RNA-Typen. Sie sind für die Translation, also für die Herstellung von Proteinen aufgrund der transkribierten Informationen, die von der DNA kommen, wichtig.

• mRNA ist die transkribierte Information der DNA und wird zur Proteinherstellung translatiert.
• tRNA stellen die richtigen Aminosäuren je Kodon zur verfügung.
• rRNA ist ribosomale RNA, also Bestandteil des Ribosoms (welche Proteine herstellen). 

Ein Genom ist das komplette genetische Material eines Organismus. Es besteht aus:

• Gene (kodierende Regionen, Signale zur Expressionskontrolle) Phosphat, Ribose, Basen GCAT bzw. U
• Pseudogene wie ein Gen, ohne kodierende Region
• strukturelle Sequenzen: für die funktionale Organisation der DNA, Centromere (Verteilung nach Duplikation), Telomere (Def.&Funkt. der DNA-Enden), ORI, Scaffolt Attachment (Organisation im Zellkern)
• Integrierte Fremd-DNA: Viren, Plastiden-DNA 
• Junk-DNA: unbekannte Funktion
• Transposons und Retrotransposons: DNA-Elemente, die sich im Genom bewegen

=>kodierende Region: Exons

=>nicht-kodierende Region: Introns

Anzahl Gen-Duplikate. Die Genomgröße korreliert nur schwach mit der Genanzahl. 

• Isolierte DNA Fragmente oder Gemische von DNA Fragmenten werden in Plasmide (oder andere Vektoren, je nach Größe der zu klonierenden DNA) ligiert
• in E.coli (oder anderen Mikroorganismen) vermehrt.
• Der Klonierungsvektor enthält:
  • ORI,
  • Polylinker (mit Reaktionsschnittstellen, für die Insertion der DNA)
  • Selektionsmarker/Selektiongen

Schritte:

• Isolieren des Gens
• Gen und Vektor mit Restriktionsenzym schneiden
• Gen und Vektor-DNA verknüpfen/ligieren (DNA in Vektor insertieren)
• rekombinanter Vektor durch Infektion, oder Transformation einfügen in die Empfängerzelle
• Empfängerzellen, welche den Vektor aufgenommen haben selektionieren Klone mit dem gesuchten DNA-Fragment isolieren 

Die DNA muss durch mechanischen (Ultraschall, Scherkräfte), oder enzymatischen (Topoisomerasen, unspezifische DNAsen, oder Restriktionsenzyme(spezifisch)) Stress geschnitten werden.

Isolierung eines Gens

• Heraustrennen einer bestimmten Region der DNA aus der Gesamt-DNA 
  • Zerschneiden der DNA (mech. oder enz.)
    • Trennen der DNA-Fragmente (Gelelektrophorese)
    • PCR

• Vermehrung dieses Stücks
  • Klonieren in bakterielle Plasmide
  • PCR

• Nachweis der Identität, Bestimmung der Sequenz
  • Restriktionsanalyse
  • PCR
  • Hybridisierung
  • Sequenzierung 

Nucleinsäurehybridisierung: Zwei Nucleotidstränge mit komplementären Basen bilden einen Doppelstrang. (Hybrid auch stabil, wenn nicht ganz komplementär)
=>Gen-Sonde = Nucleotidsequenz, welche für die Hybridisierung eingesetzt wird, werden radioaktiv, oder mit fluoreszierenden Gruppen markiert.

Immunscreening: Ein vom gesuchten Gen codiertes Protein wird mit Antikörpern identifiziert. Gen muss dazu von der transformierten Zelle exprimiert werden 

• ORI (für die Vermehrung des Plasmids),
• Polylinker (für die Insertion der DNA, enthält Reaktionsschnittstellen) und
• Selektionsmarker/Selektionsgen (Selektionieren von Bakterienzellen, die das Plasmid aufgenommen hat) 

Als Klonierungsvektoren kommen DNA-Elemente zum Einsatz, wie Plasmide, welche man aus Bakterien isoliert und den Anforderungen anpasst. Daneben lassen sich Bakterienviren und künstlich hergestellte Vektoren verwenden.

1)Plasmid: ringförmiges DNA-Molekül, repliziert unabhängig vom Bakterienchromosom. Plasmide besitzen unter Anderem eine DNA-Sequenz mit vielen Schnittstellen (Polylinker), in welche sich DNA-Fragmente integrieren lassen. Diese Polylinker sind häufig in die codierende Region eines Gens integriert, welches dadurch seine Funktion verliert. Das bewirkt eine Änderung des Phänotypen, was für eine Selektion nützlich ist.

2)Bakteriophage: Der λ-Phage ist ein Virus, der in modifizierter Form DNA-Sequenzen integrieren kann und ist somit ein nützlicher und viel verwendeter Klonierungsvektor. Cosmide sind eigentlich Plasmidvektoren, besitzen aber Abschnitte eines λ-Phagen, die sog. cos-Sequenzen.

3)Klonierungsvektoren: YAC-Vektoren (yeast), BAC-Vektoren (bacterial), HAC-Vektoren (human artificial chromosom)=>künstliche Chromosome

Plasmid: gut für kürzere klonierbare DNA-Sequenzen, einfach zu benutzen

λ-Phage: gut für kürzere klonierbare DNA-Sequenzen, hohe Transformationseffizienz

Cosmid: gut für mittellange klonierbare DNA-Sequenzen, hohe Transformationseffizienz  

BAC: gut für längere klonierbare DNA-Sequenzen, Stabilität langer Inserts
YAC: gut für sehr lange klonierbare DNA-Sequenzen, Stabilität langer Inserts 

Klonierungsvektoren = Vektoren, mit denen gewünschte DNA vermehrt wird.

Expressionsvektoren = Vektoren, die ihre Wirtszelle dazu veranlassen ein gewünschtes Produkt herzustellen. Dafür müssen sie die notwendigen regulatorischen Sequenzen für die Transkription und die Translation klonierter Gene enthalten:

Eine Zelllinie braucht das isolierte Gen, davor muss ein Promoter, der von der Zielzelle erkannt wird, eingebaut werden.
Signalsequenzen (Promoter, Terminator, Enhancer...)
Promoter-spezifische Polymerase 

Spezifischer DNA Nachweis führt immer über Basenpaarung zweier komplementärer DNAs (=Hybridisierung, Annealing)

Hybridisierung

• ein Vorgang, bei dem sich an ein Einzelstrang einer DNA ( Southern Blot) oder einer RNA (Northern Blot) ein mehr oder weniger vollständig komplementärer DNA- bzw. RNA-Einzelstrang anlagert.
• Hybridisierende DNA (Sonde), welche Radioaktiv oder Fluoreszierend markiert werden kann
• qualitativer Nachweis (vorhanden, oder nicht) und Aussage über Position in der Zelle

Sequenzierung  

• Sanger-Sequenzierung: 
  • Synthese beginnt an zugegenen Primer
  • endet durch statistischen Einbau eines Dideoxinucleotides (ddNTP)
  • Fragmente werden durch Elektrophorese der Länge aufgeteilt
  • Länge zeigt Postition der entsprechenden Base an da ddNTP Fluoreszierend sind
  • Abfolge der Farben auf der Längenleiter ergibt die Sequenz

Restriktionsanalyse  Behandlung mit spezifischen Restriktionsenzymen (schneiden DNA spezifisch an Erkennungssequenzen), Auftrennung mittels Gelelektrophorese und Analyse

=>Southern Blot: nach Gelelektrophorese: Stränge durch Alkalien spalten, auf Membran übertragen (blotting), Hybridisieren, oder Färben und analysieren.
 

PCR:  Man kann bekannte Teilsequenzen vervielfältigen (falls vorhanden) und nach Anfärben nachweisen. 

Die PCR eignet sich für den Nachweis von kurzen Genstücken. Sie ist jedoch fehleranfällig und hat eine tiefe Nachweisgrenze 

• Denaturierung
  • Stränge trennen sich bei 90C
• Annealing
  • Primeranlagerung
• Extension
  • Strang wird durch Polymerase komplementär ergänzt

Die nachzuweisende RNA muss zuerst durch das Enzym Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben werden.
Northern Blot: RNA ist schon einzelsträngig, sie muss nicht mehr aufgetrennt werden. Die benutzte Gensonde besteht dafür aus DNA und nicht aus RNA, wie beim Southern Blot. 

enzymatische Methode

• Die DNA wird ausgehend von einem synthetisch hergestellten Primer durch DNA Polymerase neu synthetisiert. Dabei ist neben der normalen dNTP auch ein wenig ddNTP vorhanden. (ddNTP fehlt die 3’OH-Gruppe an der Ribose=>DNA-Moleküle mit ddNTP können nicht verlängert werden.)
• Entweder ein ddNTP, oder der Primer werden zum Nachweis der neu synthetisierten DNA radioaktiv, oder mit fluoreszierender Gruppe markiert.
• Das entstandene Gemisch wird mittels Gelelektrophorese getrennt. Um zu unterscheiden, welches ddNTP an welcher Stelle eingebaut wird, werden entweder vier Reaktionsansätze mit je einem ddNTP, oder ein Reaktionsansatz mit vier ddNTPs gemacht, wobei diese dann unterschiedlich gefärbt sind. 

• Durch Verteilung von DNA tragenden Partikeln auf einer Oberfläche wird erreicht, dass ein definiertes DNA-Molekül an einer bestimmten Messposition fixiert ist und sich vermehren kann.
• Anschließend wird die Sequenz der DNA durch Synthese ermittelt.
• Bei der Pyrosequenzierung wird ein bei der Polymerisation frei werdendes Pyrophosphat in ein Lichtsignal umgesetzt. Es kann nur ein Lichtsignal erzeugt werden, wenn ein Nukleotid an der augenblicklich letzten Position der DNA eingebaut werden kann.