10 a Praktikum - PCR Restiriktionsanalyse

Eine besondere Bedeutung als Werkzeuge in der Gentechnologie haben Restriktionsendonukleasen (Restriktionsenzyme), die nur bei Bakterien vorkommen. Bakterien schützen sich mit Hilfe dieser Enzyme vor dem Eindringen fremder DNA. Ihre eigene DNA wird mit spezifischen Methylasen durch Anheftung von Methylgruppen modifiziert. Fremde, in die Bakterienzellen eingedrungene DNA, unterliegt dieser Modifikation nicht. Sie wird deshalb durch die Restriktionsenzyme hydrolysiert und verliert ihre biologische Funktionalität.

Restriktionsenzyme werden in drei grosse Klassen eingeteilt. Typ I und III der Restriktionsenzyme binden an ihre Erkennungssequenzen, spalten die DNA aber an einer entfernten Stelle. Im Gegensatz dazu spalten die Restriktionsenzyme des Typs II die DNA innerhalb ihrer Erkennungssequenzen.

Die meisten Erkennungssequenzen sind umgekehrte Wiederholungssequenzen mit einer Symmetrieachse (Palindrome) und vier bis acht Basenpaare lang. In Abbildung 1 ist die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym EcoRI gezeigt. Diese Abkürzung steht für Escherichia coli, Stamm RY13, Restriktionsenzym I.

Die meisten Restriktionsenzyme bestehen aus zwei identischen Proteinuntereinheiten. Jede Untereinheit erkennt und spaltet die DNA auf einem der beiden Stränge. Dies führt zu einem Doppelstrangbruch. Viele Restriktionsenzyme des Typs II führen versetzte Schnitte durch, aus denen kurze, einzelsträngige Überhänge hervorgehen, die sogenannten klebrigen Enden (sticky ends). Andere Restriktionsenzyme spalten beide DNA-Stränge an genau gegenüber liegenden Stellen, was zu glatten Enden (blunt ends) führt.

(Durch den Einsatz verschiedener Restriktionsenzymen kann man eine genau definierte Sequenz aus einem DNA-Strang herausschneiden. Die entstehenden DNA-Fragmente können dann z. B. in mit den gleichen Restriktionsenzymen behandelte Plasmidvektoren zur Genexpression in E. coli eingesetzt werden. Heute sind etwa 300 Restriktionsenzyme mit unterschiedlichen Erkennungssequenzen kommerziell erhältlich. Die Tabelle 1 listet einige Restriktionsenzyme auf.)

DNA-Fragmente lassen sich in der Gelelektrophorese mithilfe eines elektrischen Feldes nach ihrer Grösse trennen. Das Gel einer solchen Gelelektrophorese besteht üblicherweise aus Agarose, einem gelatineähnlichem Polysaccharid, das aus Meeresalgen gewonnen wird. Agarose ist ein Pulver, das sich nur in heissem Wasser löst. Kühlt die Lösung ab, dann erhärtet die Agarose. Um die DNA aufzutrennen und sichtbar zu machen, lässt man die Lösung auf einem horizontalen Träger abkühlen, wodurch ein flaches Gel von etwa 6 mm Dicke entsteht. An einem Ende wird vor dem Abkühlen ein Kamm eingeschoben. Nach dem Erhärten wird der Kamm gezogen und in dem Gel bleiben kleine Taschen zurück.

Die Grösse der untersuchten DNA bestimmt die Art des Gels, das für die Auftrennung verwendet wird. In der Regel ist es Agarose, doch sehr kleine DNA-Moleküle zwischen 50 und 1000 Basenpaare werden mithilfe von Polyacrylamidgelen getrennt. Diese Gele vermögen DNA-Fragmente zu separieren, die sich in ihrer Länge nur durch ein einziges Basenpaar unterscheiden, z.B. nach einer DNASequenzierung.

Das Agarosegel wird in einer Kammer, die an einem Ende eine positive Elektrode (Anode) und an dem anderen Ende eine negative Elektrode (Kathode) besitzt, mit Puffer überschichtet. Anschliessend werden die DNA-Proben in die Geltaschen geladen (Abb. 2) und eine elektrische Spannung angelegt. In dem entstehenden elektrischen Feld wandern die DNA-Fragmente nun durch das Gel. Das Phosphatrückgrat der DNA ist negativ geladen, so dass sich die Fragmente zur Anode bewegen. Dabei wirkt die erstarrte Agarose als Sieb mit kleinen Poren zwischen den einzelnen Agaroseketten. Die DNA-Fragmente müssen sich durch diese Poren zwängen und werden nach ihrer Grösse aufgetrennt, weil grössere Moleküle stärker behindert werden als kleinere.

Um die DNA sichtbar zu machen, wird das Gel aus der Kammer genommen und z.B. in eine Ethidiumbromidlösung getaucht. Ethidiumbromid interkaliert zwischen die Basenpaare der DNA. Unter UV-Licht fluoreszieren die Nukleinsäuren orange. DNA-Moleküle derselben Grösse bilden in der Regel eine scharfe Bande. Die Grösse der Fragmente lässt sich durch einen direkten Vergleich mit einem Molekülmassenstandard abschätzen, der gleichzeitig mit der Probe aufgetrennt wird (in einer anderen Bahn) und der DNA-Moleküle bekannter Grösse enthält. 

1. Für die Durchführung einer PCR sind spezifische Reagenzien notwendig. Die zu vervielfältigende Probe wird als DNA-Matrize (engl. template) bezeichnet. Die Matrize ist doppelsträngig und für die Reaktion reichen extrem kleine Mengen aus - theoretisch würde sogar ein einziger DNAEinzelstrang reichen.
2. Das zweite essenzielle Reagenz ist ein Primerpaar mit Sequenzen, die komplementär sind zu den Enden der DNA-Matrize. Bei den DNA-Primern handelt es sich um einzelsträngige Oligonukleotide mit einer Länge von etwa acht bis 20 Nukleotiden. Ein Primer lagert sich an das 3'-Ende des Sense-Stranges, der andere an das 3'-Ende des AntisenseStranges der Zielsequenz. Weil die Primer spezifisch sind, kann die Matrize auch gemischt mit anderen DNA-Sequenzen vorliegen, die Reaktion wird dennoch spezifisch ablaufen.
3. Das dritte Reagenz ist eine Mischung aus Nukleosidtriphosphaten und das vierte ist die Taq-DNAPolymerase aus Thermus aquaticus, die die einzelnen Kopien synthetisiert.

Der grundlegende Mechanismus besteht aus der Hitzedenaturierung der Matrize, der Anlagerung der Primer und der Herstellung der komplementären Kopie durch die DNA-Polymerase. Diese drei Schritte werden mehrfach wiederholt, bis von einer Matrize Millionen identischer Kopien synthetisiert wurden. Eine sehr geringe DNA-Menge wird auf diese Weise exponentiell kopiert, so dass sie in einen Vektor kloniert und auf einem Agarosegel sichtbar gemacht werden kann. Der Prozess erfordert einen zyklischen Temperaturwechsel. Dieser wird durch eine Apparatur bewerkstelligt, die als Thermocycler bezeichnet wird und deren Heizblock die Temperatur extrem schnell verändern kann. Ein Zyklus ist innerhalb von Minuten beendet und wird mehrmals wiederholt:

- die Temperatur wird auf 94 °C erhöht: Denaturierung der Matrize;

- die Temperatur wird auf 50 - 60 °C gesenkt: Anlagerung der Primer, dabei ist die Temperatur von der Länge und der Sequenz der Primer abhängig;

- die Temperatur wird auf 72 - 74 °C erhöht: Synthese der neuen DNA durch die TaqPolymerase.

Plasmide sind ringförmige DNA-Moleküle, die eine Startstelle für die DNA-Polymerase besitzen (origin of replication, ori) und sich deswegen unabhängig vom bakteriellen Chromosom replizieren.

Die natürlich vorkommenden Plasmide können Gene für einen Transfer zwischen Bakterienzellen oder Gene für Antibiotikaresistenzen tragen. Plasmide können nach der Lyse der Bakterien durch Fällung mit Salzlösung und Zentrifugation vom bakteriellen Chromosom abgetrennt werden. Für den Einsatz in der Gentechnik müssen die "natürlichen Plasmide" zu Klonierungs- bzw. Expressionsvektoren modifiziert werden.

Um das Einfügen der fremden DNA zu erleichtern, verfügen die Klonierungsvektoren über eine sogenannte Polyklonierungsstelle (engl. multiple cloning site, MCS, Abb. 4). Sie besteht aus einer Basensequenz, in der hintereinander die Schnittstellen häufig verwendeter Restriktionsenzymen eingefügt sind. Wählt man ein Restriktionsenzym aus, das die Fremd-DNA an beiden Seiten des zu klonierenden Gens spaltet und schneidet damit auch das Plasmid. Dann können sich FremdDNA und Plasmid-DNA über ihre sticky ends miteinander verbinden. Mit Hilfe der DNA-Ligase werden zwischen Fremd-DNA und Plasmid-DNA die nötigen Phosphoesterbindungen geknüpft.

Klonierungsvektoren müssen auch über einen Marker verfügen, der die Anwesenheit des Plasmids in der Bakterienzelle nachweist. Meist geschieht dies durch Einführung eines Gens für Antibiotikumresistenz. So enthält der in Abbildung 4 dargestellte Vektor pUC18 das Ampicillinresistenzgen (ampR). Bakterien, die mit diesem Plasmid erfolgreich transformiert wurden, können auf ampicillinhaltigen Nährböden wachsen.

Bei einigen Vektoren lässt sich auch feststellen, ob sie eine Fremd-DNA enthalten oder nicht. Zum Beispiel ist beim Plasmid pUC18 die Polyklonierungsstelle in das lacZ’-Gen so eingefügt, dass die Expression der β-Galactosidase vom lacZ’-Gen nicht gestört ist. Bakterien, die mit dem ursprünglichen pUC18 transformiert wurden, können mit Hilfe der β-Galactosidase das Substrat X-Gal abbauen. Das Abbauprodukt färbt die Bakterienkolonien blau. Wird in die Polyklonierungsstelle jedoch eine Fremd-DNA eingeschleust, wird das lacZ’-Gen zerstört. Die Bakterien können die β-Galactosidase nicht mehr produzieren, und die Kolonien bleiben weiss.

Bei der Anfertigung einer Restriktionskarte werden die Schnittstellen einer Reihe ausgewählter Restriktionsenzymen auf dem Plasmid durch Ein- oder Mehrfachspaltungen kartiert. Diese Restriktionskartierung ist auch heute noch eine schnelle und einfache Methode, um z.B. die Orientierung eines einklonierten DNA-Fragmentes zu überprüfen.

Fremde Proteine können für E. coli toxisch sein, wenn sie in grossen Mengen hergestellt werden. Deshalb ist der Promotor, der die Expression der Fremd-Gene steuert, entscheidend. Um die Proteinsynthese zu regulieren, besitzen Expressionsvektoren Promotoren mit "an/aus"-Schaltern. Die Bakterienzellen vermehren sich zunächst und das Fremd-Protein wird erst zu einem späteren Zeitpunkt exprimiert.

Ein häufig verwendeter Expressionsvektor ist pET (Abb. 5). Als Selektionsmarker enthält er ein Ampicillinresistenzgen (ampR). Vor der Polyklonierungsstelle (MCS) liegt der Lactoseoperator (lacO), gefolgt vom Promotor für die virale RNA-Polymerase T7. Auch enthält das Plasmid das lacI-Gen, das für den lac-Repressor codiert. Der lac-Repressor bindet an den lac-Operator im Plasmid und verhindert die Transkription der T7-Polymerase.

In den transformierten Bakterienzellen werden die Plasmide vermehrt und die virale RNAPolymerase T7 unter der Kontrolle des lac-Promotors exprimiert. Nun setzt man den künstlichen Induktor Isopropylthiogalactosid (IPTG) zu. IPTG bindet an den lacI-Repressor, der dann den Operator frei gibt. Damit sind in der Zelle grosse Mengen an T7-RNA-Polymerase vorhanden, und die Transkription der zu exprimierenden DNA kann beginnen. Es wird sehr viel mRNA synthetisiert, die rasch in Protein translatiert wird.