11 Gentec – Gloor

• bei 95°C denaturieren DNA-Doppelstränge
• bei ca. 50-60°C annealen die Primer
• bei 72-74°C hat die verwendete DNA Polymerase ihr Temperaturoptimum !

Bestimmung der Annealingtemperatur
• die Primer sollten nur an die exakt komplementäre Sequenz binden
  • eine zu hohe Temperatur lässt keine Bindung zu
  • eine zu tiefe Temperatur lässt auch Bindungen zu, die nicht zu 100% komplementär sind
=> irgendwo dazwischen liegt ein Temperaturoptimum

Tm = 4 x (Anzahl CG bp) + 2 x (Anzahl AT bp)

Die Taq Polymerase
• die Fehlerrate der Taq Polymerase liegt be ca. 1/104 (wegen fehlender 3’-5’ Exonuklease Aktivität)
• wegen Fehlerfortpflanzung kann nach 30 Zyklen im Durchschnitt alle 300 bp ein Fehler vorhanden sein

durch Klonierung und Sequenzanalyse können fehlerfreie DNA Moleküle identifiziert werden

• PCR Primer müssen am 3’-Ende perfekt mit der Matrize basenpaaren, damit die DNA Polymerase polymerisieren kann
• aber: an den 5’-Enden müssen die Primer nicht zwingend mit der Matrize basenpaaren => am 5’-Ende können die Primer zusätzliche Basen erhalten, die z.B. ein Erkennungsmotif für ein Restriktionsenzym enthalten

Bessere Primer, damit PCR DNA auch “genetisch korrekt” in einen Vektor gebaut werden kann
• das PCR Produkt ist stumpfendig und hat an den Enden keine Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme
=> ein PCR Fragment kann präzise (Leseraster) in einen Vektor eingebaut werden

Austausch einer Base. Das Leseraster bleibt erhalten
Transition (Purin -> Purin bzw. Pyrimidin -> Pyrimidin)
Transversion (Purin -> Pyrimidin bzw. Pyrimidin -> Purin)

s.B.

Polymorphismus (SNP, Single Nucleotide Polymorphism)
eine spezifische Position im Genom, die zwischen den Mitgliedern einer Population verschieden ist

Eine Sequenz enthält beispielsweise bei Person 1 eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym, in der Sequenz bei Person 2 kommt diese nicht vor. Werden nun diese Sequenzen mit einem Restriktionsenzym geschnitten, entstehen bei Person 1 zwei Fragmente und bei Person 2 ein Fragment. Werden nun die Längen der Sequenzen verglichen, kann ein RFLP festgestellt werden, die Fragmente sind unterschiedlich lang, der Locus ist polymorph.

eine spezielle Form von SNP, bei der als Folge der Punktmutation für ein Restriktionsenzym eine Erkennungsstelle generiert oder zerstört wird
• ist die Stelle bekannt, kann mit Hilfe genomischer DNA eine Analyse durchgeführt werden:
- PCR eines DNA Abschnittes mit dem RFLP
- Restriktionsverdau
- Auftrennung der Fragmente nach Grösse
- Unterscheidung

kurze repetitive Sequenzen (ca. 2 – 12 Basen), die ca. 5 – 20 mal hintereinander angeordnet sind
• die Wiederholungszahl ist für jedes Individuum spezifisch
• mit PCR kann die Wiederholungszahl bestimmt werden

das häufigste menschliche STR ist [CA]n (5 < n < 20)
• in einem Individuum existieren mehrere Allele des [CN]n STR
• für die Individuumsidentifizierung müssen die flankierenden DNA Sequenzen bekannt sein
• in einer PCR Reaktion mit der Primermischung für mehrere [CN]n STRs werden alle Bereiche gleichzeitig amplifiziert (multiplex PCR)

Verwandtschaftsanalyse können mit STR-PCR durchgeführt werden • 3 der 4 Kinder haben STR 12 vom Vater geerbt => noch keine zwingende Schlussfolgerung, dass die 3 Kinder Geschwister sind, auch wenn das Allel “STR 12” sehr selten wäre
• mit der Analyse mehrerer STR Bereiche aus DNA beider Erwachsenen und aller Kinder kann die Zuordnung gesichert werden

wie kann “kein Signal” (weibliche DNA Probe) von “PCR hat nicht geklappt” unterschieden werden?
• das Amelogenin Gen (ein Protein für Zahnschmelzbildung) kommt auf X- und Y-Chromosom vor. Xund Y-Kopie unterscheiden sich jedoch durch Anbzw. Abwesenheit kurzer DNA Bereiche

t-PA (tissue-type plasminogen activator)
• t-PA katalysiert die Auflösung von Fibringerinseln, die nach Herzinfarkten oder Schlaganfällen entstehen können. Es existieren verschiedene gentechnisch modifizierte Varianten von t-PA, die verbesserte Halbwertszeiten haben

Insulin
• Bei Insulinmangel eingesetzt. Der Welt-Jahresbedarf liegt bei 5-6 Tonnen! Dieser Bedarf lässt sich nicht mehr über Schlachtschweine decken 

• AT III ist ein Serin-Proteasehemmer, der bei der Kontrolle der Blutgerinnung eine wichtige Funktion einnimmt
• Produktion des menschlichen ATIII in Ziegen
• Gewinnung von AT III aus Ziegenmilch

Adenoviren als Vektoren für die Gentherapie
• Adenoviren sind relativ einfache doppelsträngige DNA-Viren
• die DNA besteht aus 36’000 bp
• die Hülle (Proteine) besteht aus 240 Hexonen (Trimere des Hexonproteins) und den Pentonproteinen
• Adenoviren verursachen nur schwache Infektionen von Epithelzellen
• Adenoviren sind nicht onkogen
• Adenoviren lassen sich leicht kultivieren und in grossen Mengen produzieren
• Adenoviren sind gut untersucht, u.a. ist das gesamte Genom sequenziert

• Wechselwirkung mit Integrinen und CAR Proteinen
• Bildung eines Vesikels
• Auflösung des Vesikels und Interaktion mit einer Kernpore
• Einschleusen der viralen DNA in den Zellkern

• die Viren sollen replikationsdefizient sein. Geschieht durch Deletion im e1a Gen
• das E1A Protein aktiviert Transkription anderer viraler Gene und inhibiert das Wirtsprotein Rb. Rb verhindert durch Binden von E2F das Eintreten der Zelle in die S-Phase
=> Viren mit defektem E1A:
- infizierte Zelle wird nicht in die S-Phase getrieben
- eine Aktivierung der Transkription - eine Transkription der viralen Gene
• Deletion weiterer nicht essentieller Gene, denn die zu verpackende rekombinante DNA mit dem Ersatzgen darf max 5% länger sein, als die natürliche DNA

Wie funktioniertdas System ? • Bakterien entahlten das Gen für eine Endonuklease, die DNA-Doppelstrangbrüche generieren kann
• Diese Endonuklease wird über eine vermittelnde RNA an die richtige DNA Sequenz geführt
• Die PAM Sequenz ist evtl. am Schmelzen der Ziel-DNA beteiligt: Begünstigung der DNA-RNA Hybridbildung

https://www.youtube.com/watch?v=2pp17E4E-O8

Rekombinante Proteine sind biotechnologisch hergestellte Proteine, die mit Hilfe von gentechnisch veränderten Organismen oder mit transient transfiziertenZellkulturen erzeugt wurden.

• das (in der Regel humane) Gen, das für das Protein codiert (nur die codierende Sequenz, in klonierter Form)
• der Organismus, in welchem das rekombinante Protein hergetellt werden soll
• Plasmide/Vektoren: biologische Trägermoleküle des Gens
• die experimentelle Vorgehensweise, um das rekombinante Protein aufzureinigen
• ein biologisches System, um die Funktionalität des rekombinanten Proteins zu testen

das Gen eines humanen Proteins: cDNA Synthese (wegen Exon/Intron Struktur)

Die cDNA (englisch complementary DNA, deutsch komplementäre DNS) ist eine DNA, die mittels des Enzyms Reverse Transkriptase aus RNA (wie mRNA undncRNA) synthetisiert wird.

Einige Vorteile des bakteriellen Expressionssystems
• Bakterien sind einfach in der Handhabung und “billig”
• mit Bakterien können in der Regel technisch einfach grosse Proteinmengen hergestellt werden
• Bakterien können einfach genetisch verändert werden
• in Bakterien können auch für das Bakterium schädlicheProteine einigermassen effizient hergestellt werden

Einige Nachteile des bakteriellen Expressionssystems
• sekretierte Proteine werden in Bakterien oft nicht richtig gefaltet (kein endoplasmatisches Reticulum, andere Redoxbedingungen) und sekretiert
• Bakterien prozessieren Proteine anders als eukaryontische Zellen (Glycosylierung, proteolytische Prozessierung)
• bei der Aufreinigung können bakterielleKomponenten als Kontaminationen vorhanden sein: Endotoxine (Lipopolysaccharide, d.h. Membranbestandteile), Lösen beimMenschen Fieber und Entzündungsreaktionenaus

Plasmide sind:
• DNA Moleküle, nicht Bestandteil des Chromosoms, autonom replizierend
• natürlich vorkommend (in Bakterien, Hefen), und gentechnisch umgebaut
• ringförmig, doppelsträngig, mit Genen, die für das Bakterium wichtig sind
• für die Gentechnik: “Trägermoleküle” für “das Gen”

• Plasmide werden bei der Zellteilung weitergegeben
• Plasmide kommen in vielfacher Kopie pro Zelle vor (10 bis > 100)
• Plasmide werden bei der Zellteilung zufällig auf die Tochterzellen verteilt
• Für die Proteinherstellung werden Plasmide verwendet, die unabhängig vom Genom repliziert werden und in sehr hoher Kopienzahl vorkommen

bei der in vitro Synthese von DNA (z.B cDNA Synthese) können Fehler entstehen. Für die korrekte Herstellung eines rekombinanten Proteins muss jedoch jedes hergestellte DNA Molekül die richtige Sequenz haben
 => ausgehend von einem einzigen DNA Molekül müssen genügend genetisch identische Moleküle hergestellt werden, damit Gentechnik betrieben werden kann

diese Anforderung wird erreicht, indem 1 DNA Moleül in 1 Bakterium eingeschleust wird: Transformation von Bakterien
-> aus jedem Bakteriumwird eine Kultur hochgezogen (eine grosse Population genetisch identischer Bakterien, ein Klon)
-> Durch die Klonierung kann die DNA des Gens jederzeit rasch und in grossen Mengen hergestellt werden

Aber: wenn DNA Moleüle bei der Synthese Fehler bekommen, dann wird es auch Klone mit Fehlern geben => die DNA von mehreren bakteriellen Kulturen (von mehreren Klonen) muss analysiert werden: DNA Sequenzanalyse

• der circuläre Vektor wird mit einer Restriktionsendonuklease linearisiert
• der DNA Abschnitt mit dem Gen wird mit dem linearisierten Vektor gemischt
• die freien DNA Enden werden mit dem Enzym DNA Ligase verbunden
• => Vektorenden und Genenden müssen passen (kompatible Enden)

• Restriktionsendonukleasen sind bakterielle Endonukleasen, die doppelsträngige DNA spalten
• Spaltung bedeutet Hydrolyse einer Phosphoesterbindung • Restriktionsendonukleasen sind in der Regel homodimere Proteine, die spezifisch mit DNA Basen wechselwirken
• die in der Gentechnik verwendeten Restriktionsendonukleasen erkennen palindrome DNA Sequenzen und produzieren nach der Hydrolyse ein 5’-Phosphat und ein 3’-OH Ende

5‘-G A A T T C-3‘
3‘-C T T A A G-5‘

• EtBr absorbiert im UV Bereich (ca. 300 nm)
• EtBr emittiert im sichtbaren Bereich (ca. 600 nm, orange)
• Emission eines interkalierten EtBr Moleküls ist ca. 50-100x höher als Emission eines freien EtBr Moleküls

die DNA Synthese bricht ab, wenn ein ddNTP eingebaut wird, weil die freie 3’– OH Gruppe fehlt

durch die Verwendung von markierten Molekülen (früher Radioaktivität, heute fluoreszierende Primer) können die neu synthetisierten DNA Moleküle sichtbar gemacht werden
• mit Acrylamid Gelelektrophorese werden die markierten DNA Moleküle nach Grösse aufgetrennt. Diese Technik erlaubt, DNA Moleküle zu trennen, die sich um ein Nucleosidmonophosphat unterscheiden (n Basen vs. n+1 Basen)

früher • vertikale Gele (ca. 50 cm lang, 0.3 cm dick)

heute • Kapillaren (50-80 cm lang, Durchmesser 0.1 cm) (s.B.)

Promotor • die Bindungsstelle für die RNA Polymerase

Operatorbereich • DNA Abschnitt, an den Regulationsproteine binden (regulieren Bindung der RNA Polymerase)

• in Abwesenheit von Laktose werden die Enzyme für den Metabolismus von Laktose nicht benötigt. Der Repressor ist am Operator gebunden => keine Expression
• wenn Laktose vorhanden ist, wirken einige Laktosemoleküle als Induktor. Die Enzyme für den Metabolismus werden nun produziert (IPTG ist der synthetische Induktor)

=> Laktose wirkt als allosterischer Regulator. Laktose reduziert die Affinität des Repressors an den Operator 

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) ist ein Galactose-Thioglycosid (S-Glycosid), welches als künstlicher Induktor des Lactose-Operons in Escherichia coli verwendet wird.

• durch den lac Repressor (das Gen kommt im Genom und auf dem Expressionsvektor vor) wird die Expression der T7 RNA Polymerase verhindert, deren Gen im Genom des Bakterienstamms BL21 integriert ist
• die T7 RNA Polymerase bindet sehr spezifisch an eine ca. 20 bp lange Sequenz , den T7 Promotor
• durch den lac Repressor wird zusätzlich verhindert, dass eine bakterielle RNA Polymerase das “fremde Gen” auf dem Expressionsvektor exprimieren kann
• die Induktion mit IPTG ermöglicht die Produktion der T7 Polymerase, die nun das ebenfalls nicht mehr reprimierte “fremde Gen” exprimieren kann

• das Einschleusen von Plasmid DNA in ein Bakterium (Transformation) ist ein sehr ineffizienter Prozess
• über den Selektionsmarker (Resistenz gegen ein Antibiotikum) können aus Milliarden von Bakterien sehr einfach diese Bakterien identifiziert werden, die erfolgreich transformiert wurden. Aber: mit der Selektion wird nicht nach der Anwesenheit des Gens selektioniert!
• resistente Klone (aus einem transformierten Bakterium entstandene Population) müssen auf die Anwesenheit (und Korrektheit) des Gens analysiert werden (1020 Klone, Restriktionsanalyse DNA Sequenzanalyse)

Nachweis des rekombinanten Proteins: Western Blot ein korrekter Klon ist gefunden. Wird auch das Protein gemacht?
• Acrylamid Gelelektrophorese (SDS PAGE)
• Auftrennung aller Proteine eines Klons nach Masse der Proteine
-> Welches Protein ist das Richtige? Aufgrund der berechneten Masse des rekombinanten Proteins kann nur vermutet werden 
• Transfer aller Proteine auf eine dünne Membran (Cellulose, Nylon)
• Identifikation des Proteins mit Hilfe von Antikörpern