10 Blut - Gloor

das lösliche Protein Fibrinogen muss in ein fasriges Polymer überführt werden, das zusammen mit den Thrombocyten den Thrombus bildet:
• das Gerinnungssystem ist als doppeltes enzymatisches Kaskadensystem (Aktivierungssystem) aufgebaut
• doppelt bedeutet: ein extravaskuläres (exogenes) System und ein intravaskuläres (endogenes) System sind beteiligt
• beide Systeme konvergieren mit den Gerinnungsfaktoren V und X (FX, FV)
• die beteiligten Enzyme sind Serinproteasen
• die zuletzt aktivierte Protease ist Thrombin (aus Prothrombin)
• Thrombin entfernt kurze Peptide von Fibrinogen => nicht kovalente Polymerisation von Fibrinogen zu Fibrin
• Thrombin aktiviert zusätzlich FXIII
• FXIIIa verknüpft die Fibrinfibrillen kovalent

• an der Gerinnung sind 13 Faktoren beteiligt
• Faktor IV (FIV) ist Ca2+, alle anderen Faktoren sind Proteine
• die Faktoren II, VII, IX, X, XI und XII sind Proteasen
• Startpunkt für das extravaskuläre System ist Gewebethromboplastin (tissue factor): Membranprotein, konstitutiv von nichtvaskulären Zellen exprimiert
• das extravaskuläre System aktiviert Thrombin in Sekunden
• das intravaskuläre System läuft erst nach einigen Minuten an
• ein wichtiger Cofaktor für die Gerinnungskaskade ist Ca2+

• Ca2+–Ionen binden FII, VII, IX und X durch Komplexbildung an die Thrombocyten
• Ca2+-Ionen können 6 Kooridnationsbindungen eingehen:
seitens der Gerinnungsfaktoren kommen freie Elektronenpaare modifizierter Glu Seitenketten: γ-Carboxy-Glutamat (Gla)
seitens der Thrombozytenmembran kommen freie Elektronenpaare der Phosphatgruppen der Phospholipide

sB

die Polymerisation von Fibrinogen zu Fibrin:
• Startpunkt sind lösliche Fibrinogenmoleküle, an welchen Thrombin durch Hydrolyse von Peptidbindungen kurze N-terminale Peptide entfernt: Fibrinopeptide A und B
=> die neu exponierten N-terminalen Enden wechselwirken nicht-kovalent (H...Brücken, hydrophobe WW) mit C-terminalen Fibrindomänen
• FXIIIa verknüpft Fibrinpolymere kovalent
• Fibrinpolymere lagern sich zu „Proteinfasern“ zusammen => vollständiger Thrombus

die Struktur von Fibrinogen:
• Fibrinogen ist ein homodimeres langestrecktes schweres Protein (ca. 340‘000 g/mol)
• jedes „Monomer“ besteht aus 3 Polypeptidketten => insgesamt 6 Polypeptidketten
• die 3 Polypeptidkettten (α, β, γ) sind untereinander über S–S Brücken verküpft
• die beiden Monomere sind über S–S Brücken verknüpft
• die 3 Ketten bilden eine Tripelhelix
• β- und γ-Untereinheit haben strukturierte hydrophobe C-terminale Domäne
• α-Kette hat unstrukturierte C-terminale Domäne

sB

Die Fibrinolyse:
• die Proteasen der Fibrinolyse (Gewebe-PA (t-PA), Plasmin) sind ebenfalls Serinproteasen
• t-PA ist in Gefässen an Endothelzellen gebunden, wird durch Thrombin freigesetzt
• t-PA bindet Fibrin sehr gut, wird aber auch schnell durch Serinproteaseninhibitoren (Serpine) inaktiviert
• t-PA enfaltet bereits als Proenzym katalytische Aktivität
• Plasmin inaktiviert zusätzlich die Faktoren V und VIII und kann Fibrinogen abbauen

Heparin (bzw. Heparansulfat):
• Heparine sind Zuckerpolymere bestehend aus sulfatierten Aminozuckern (Masse zwischen 4000 und 40‘000 g/mol)
• Heparine binden an das Serpin AT III (an Lysinseitenketten)
=> stark erhöhte Bindungsaffinität von AT III an Thrombin (und andere Gerinnungsproteasen)
  => Gerinnungshemmung

Calciumchelatoren:
• Citrat und Oxalat sind natürliche Calciumchelatoren
• EDTA ist ein synthetischer hochaffiner Calciumchelator

Vitamin K ist ein Cofaktor im Prozess der Glutaminsäure Carboxylierung

Vitamin K Antagonisten wirken als kompetitive Hemmstoffe der Carboxylierung
=> Hemmung der Blutgerinnung

Das Protein C und Protein S System:
• Protein C ist eine Protease, wird durch Carboxylierung von Glutaminseitenketten (Vitamin K abhängig) modifiziert wird
• Aktivierung von Protein C erfolgt durch Thrombin, insbesondere wenn Thrombin an Thrombomodulin (TM) gebunden ist (Änderung der Substratspezifität)
• der Komplex Protein C–Protein S inaktiviert die Faktoren Va und VIIIa

Serpine:
• eine Familie strukturell ähnlicher Proteine, die Serinproteasen irreversibel hemmen
• Serpine verhalten sich wie ein Substrat, verhindern jedoch durch Konformationsänderung den Deacylierungsschritt des Enzym-Substrat Komplexes

• die meisten an der Gerinnung beteiligten Proteine sind Proteasen
=> ihre Aktivität muss kontrolliert sein
• allgemeine mögliche Kontrollmechanismen sind: geringe Konzentration, Aktivierung durch andere Enzyme, hohe Substratspezifität, Kompartimentalisierung, Regulation über Cofaktoren, spezifische Inhibitoren (z.B. auch andere Proteasen)
Aber:
• die Gerinnung muss bei Bedarf auch rasch einsetzen
=> Proteasen sind „langsam“
• eine Kaskade bewirkt eine grosse Verstärkung der enzymatischen Aktivität, die Startmoleküle sind nur gering konzentriert und es existieren viele Regulationsorte

sB

• ein Mangel an Hemmstoffen der Gerinnung begünstigt die Bildung von Thromben • häufigste Ursache für Thrombenbildung ist APC-Resistenz: das aktivierte Protein C kann Faktor Va nicht spalten (abbauen), da eine Mutation im Faktor V-Gen die Aminosäure an der proteolytischen Inaktivierungsstelle von Va verändert hat
=> „optimale“ Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin

• intrazelluläres Muskelprotein aus 153 Aminosäuren
• transportiert O2 in Muskelzellen
• besteht aus einer Proteinkette (153 AS) und einer Hämgruppe (Porphyrinring mit Fe2+)

Die reversible Bindung von Sauerstoff an Myoglobin basiert auf der oktaedrischen Koordination von Fe2+ innerhalb der Hämgruppe (im Porphyrinring); Das O2 geht ein (der acht) koordinativen Bindungen des Fe2+ ein und bildet zusätzlich eine H-Brücke mit einem His (so wird die oxidation von Fe2+ durch O2 verhindert).

mit Kd weiss man welche ligandkonzentration man einsetzten muss, um den Rezeptor halb zu sättigen

• bei 20% O2-Gehalt der Luft beträgt pO2 ca. 150 mm Hg
• pO2 in Lungenalveolen ca. 100 mm Hg
• pO2 im Gewebe ca. 20-30 mm Hg
• Kd von Myoglobin liegt bei ca. 2 mm Hg => unter physiologischen Bedingungen (20–40 mm Hg) ist Myoglobin mit O2 gesättigt
• O2-Abgabe durch Myoglobin nur möglich bei sehr tiefem pO2 in einer Zelle

-> dort wo myg O2 bekommt ist der druck so hoch dass es ihn gut aufnehmen kann, wo es den O2 abgeben muss ist der druck so tief dass es den O2 gut abgeben kann

• Hb ist ein Tetramer (α2β2): => 4 Globinketten, 4 Hämgruppen, 4 O2 Bindungsstellen
• die Hb Ketten sind den Myoglobinketten sehr ähnlich

• Hb mit gebundenem O2 (Oxy-Hb) hat eine andere Form als Hb ohne O2 (Desoxy-Hb) (bei Myoglobin hat die O2-Bindung keinen Einfluss auf die Myoglobinform)

• Oxygenierung von Hämoglobin ändert das Absorptionsspektrum und damit die Farbe von Blut (arterielles vs. venöses Blut)
• die absorbierende Gruppe ist das Häm
• die Hauptabsorption liegt bei ca. 400 nm (Soret-Bande)
• Die Farbgebung kommt vor allem durch die Absorption im Bereich 500-600 nm

Wie kann mit Absorptionsspektrometrie die O2-Sättigung einer Hb-Lösung bestimmt werden?
1. Absorption bei einer Wellenlänge messen, bei der Hb und HbO2 den gleichen molaren Absorptionskoeffizienten haben (z.B. bei ca. 545 nm) => Gesamt Hb-Gehalt kann mit Lambert-Beer Gesetz bestimmt werden
2. Absorption bei einer Wellenlänge messen, bei der Hb und HbO2 möglichst unterschiedliche molare Absorptionskoeffizienten haben (z.B. bei ca. 660 nm) => Hb bzw HbO2 kann mit Lambert-Beer Gesetz bestimmt werden

die experimentell beobachtete O2-Bindungskurve von Hb ist sigmoid

• eine sigmoide Bindungskurve deutet auf nicht-unabhängige O2-Bindung (kooperatives Bindungsverhalten): jede O2-Bindung beeinflusst die Affinität der nächsten O2-Bindung
• im physiologischen Bereich ist O2-Beladung/Entladung optimiert (66%) (bild rot)
• für Mb beträgt der Wert 7% (Affinität ist zu hoch) (bild grün)
• ein hypothetisches Protein ohne Kooperativität erreicht eine max. mögliche O2-Beladung/Entladung von 38% zwischen P100 und P20 (bild blau)

sB

Gleichung nicht auswendig

sB

• wenn ein Ligand eines Proteins die Bindungsstärke anderer Liganden beeinflusst, wird dies als allosterische Interaktion oder allosterische Regulation bezeichnet
• sind alle Liganden gleich, lautet die Bezeichnung homotrop
• sind die Liganden verschieden, lautet die Bezeichnung heterotrop
• Effekte allosterischer Interaktionen können positiv oder negativ sein

sB

• durch die O2-Bindung wird über das koordinativ gebundene His eine α-Helix verschoben
• diese Verschiebung führt zu weiteren Verschiebungen an den Berührungsfächen der α1β2 und α2β1 Dimere
• die Hb Untereinheiten ändern ihre Form: T-Form (ohne O2), R-Form (mit O2) • R-Form bindet O2 besser (höhere Affinität)
• der Übergang von der T- zur R-Form führt zu einer markanten Verschiebung der Anordnung der Untereinheiten
-> wäre bei myoglb nicht möglich, da es ja nur eine Bindungsstelle hat

Jedes der vier identischen Protomeren, wobei jedes davon O2 binden kann in R oder T-Form vorliegen. R und T Form stehen in einem Gleichgewicht; die Anzahl gebundener Liganden verschiebt das Gleichgewicht zugunsten der R-Form. Im Symmetrie-Modell liegen die Globinketten entweder alle in T-Form oder alle in R-Form vor.

• Desoxy-Hb liegt bevorzugt in der T-Form vor (tiefe O2-Affinität)
• Oxy-Hb liegt bevorzugt in der R-Form vor (hohe O2-Affinität)
• O2-Bindung bewirkt Übergang von der T-Form zur R-Form
=> Erhöhung der Bindungsaffinität anderer Bindungsstellen

Durch die O2-Bindung wird die Konformation dieses Globins geändert; die Konformationsänderung induziert eine Konformationsänderung in benachbarten Globinmolekülen (mehr Wechselwirkungen) wodurch wiederum die O2-Affinität erhöht wird.

• 2,3-Bisphosphoglycerat (2,3-BPG): entsteht auf einem Nebenweg der Glycolyse in Erythrocyten (ca. 5 mM)
• bindet stark an T-Form => Stabilisierung der T-Form
• 2,3-BPG ist ein heterotropher allosterischer Effektor
• bei erhöhter 2,3-BPG Konzentration erleichtert 2,3-BPG die O2 Abgabe
=> zweckmässige über die Glycolyseaktivität gesteuerte Regulation der O2 Abgabe

dieses Molekül passt in das Loch des Hb in der T form; es verschiebt das glgw in Richtung T; sauerstff abgeben
-> heterotrope allosterische Regulation