Tierzucht und Genetik für die Veterinärmedizin

Polyaminosäure-Kette biologisch inaktiv!

wird zu aktivem Protein oder Polypeptid modifiziert durch posttranslatorische Modifikationen:

• Chemische Modifikation: (Anhängen funktioneller Gruppen)

  • kleine chemische Gruppen (Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung...)

  • Zucker-Seitenketten

  • Lipid-Seitenketten

• Intein Splicing

• Faltung (alpha/beta Faltblattstrukturen)

• Proteolytische Spaltung (sequenzspezifische Proteasen -> Schneiden Proteine in aktive kleinere Proteine)

mRNA (und dessen Vorläufer hnRNA) … messenger RNA

• die einzige kodierende RNA – nur aufgrund dieses „Bauplans“ werden Proteine an den Ribosomen synthetisiert (Translation)

• wird im Zellkern transkribiert und zur fertigen mRNA (Capping, Polyadenylierung, Splicing) gereift

rRNA … ribosomale RNA (nicht kodierend)

• ist neben Proteinen ein Baustein der Ribosomen, an den Ribosomen erfolgt die Biosynthese

• wird im Nukleolus generiert und wird von der rDNA kodiert

tRNA … Transfer-RNA (nicht kodierend)

• bringen jeweils einzelne Aminosäuren zu den Ribosomen und vermittelt bei der Translation einem Codon auf der mRNA eine AS

miRNA … Micro RNA (nicht kodierend)

• miRNAs beeinflussen die Translation und/oder bauen ihre Ziel mRNA ab

Transkriptom = Gesamtheit der Transkripte einer Zelle (Struktur-RNAs, hnRNAs, mRNAs)

Gene < Transkripte (<< Proteine)

Proteom = gesamter Protein-Gehalt einer Zelle

Gene < Transkripte << Proteine

Mechanismen an der DNA (zur Vergrößerung der Vielfalt der Transkripte)

• alternative Promotoren

• alternative Transkriptionsstarts

Mechanismen an der RNA (zur Vergrößerung der Vielfalt der Transkripte)

• Alternatives Splicing

• Alternative Polyadenylierung

• RNA-Editing (Basenaustausch an der mRNA)

bei der Translation

• alternative Leserahmen (Frameshifts, ORF = open reading frame), kontrolliertes Wechseln der Leserahmens (ORF) innerhalb einer mRNA

Mechanismen am Protein (alternative post-translatorische Modifikationen, zur Vergrößerung der Vielfalt der Proteine)

• Alternative Transportmechanismen

• Faltung (AS-Sequenz bestimmt die Struktur) nur korrekt gefaltete Proteine sind biologisch aktiv

• proteolytische Spaltung

• chemische Modifikation (z.B. neue chemische Gruppen)

• Intein-Splicing (Ausschneiden eines Intein)

Direkte Gendiagnose

Genprodukt, Gen und Genvarianten sind bekannt => 100% Genauigkeit

Methode:

• Direkter molekulargenetischer Gentest für Merkmals- und Anlageträger (z.B. PSS/MHS)

• CD18 (z.B. BLAD bei europäischen Schwarzbunten)

• UMS (z.B. DUMPS bei europäischen Schwarzbunten)

• Myostatin (z.B. Muskelhypertrophie/Doppelländer bei Weiß-Blauen-Belgiern & Piemontesern)

Indirekte Gendiagnose

der genaue molekulare Mechanismus der Genwirkung und das/die beteiligten Gen(e) sind unbekannt => Darstellung über Kopplungsanalysen (=Wahrscheinlichkeitsaussage)

• Voraussetzung: Kopplung zwischen DNA-Marker und Locus < 5 cM

• Problem: Entkopplung?

Methode:

• DNA-Marker (z.B. Weaver beim Europäischen Braunvieh)

Genomkartierung = Charakterisierung von Genomen

• Zytogenetisch: Anzahl und Morphologie der Chromosomen (Idiogramm)

• Zyto-/Molekulargenetisch: Anordnung der Genloci und Allele auf den Chromosomen

• Sequenzbestimmung des Genoms Genomprojekte

Genkartierung = Charakterisierung von Genen

= Molekulargenetische Charakterisierung der funktionellen Abschnitte --> Regulatorische Sequenzen (5‘ und 3‘) + Transkribierter Bereich - kodierender Bereich (Exons - Introns)

Sequenzbestimmung des Gens

Weitere Analyse der Genexpression und Genprodukte (RNA-Analyse, Protein-Analyse)

Gen-/Genom-Karten

Lineare Anordnung der Gene bzw. DNA-Loci im Genom eines Organismus.

Das di- oder polyploide Genom muss durch 2 Gen-Karten beschrieben werden:

1. Genetische Genkarte (Kopplungskarte): zeigt die relativen Positionen von Genen und anderer Sequenz-Besonderheiten in einem Genom
   1. Crossing-over-Rate = Maß für den Abstand 2er Genorte/Loci
   2. beruht auf Kreuzungsexperimenten und Stammbaum-(Pedigree-) Analysen = Kopplungsanalysen
2. Physikalische Genkarte (zytologische Chromosomenkarte)
   1. Sequenz-Abfolge von Nukleotiden in DNA-Molekülen (Chromosomen)
   2. Fragment-Abfolge in DNA-Molekülen
   3. beruht auf molekular-genetischen Techniken (FISH, RFLP, Sequenzierung)

Def. Biologische Abstammungssicherung

Feststellung der Allele einer größeren Anzahl polymorpher Genomorte bei Eltern und Nachkommen.

Nachkommen können nur Allele tragen, die bei mind. einem der Eltern vorkommen.

Abstammungssicherung = Ausschlussverfahren

Aussage: wenn der Nachkomme Allele hat, die nicht von einem der Elterntiere stammen können, so muss dieses mögliche Elterntier von der Elternschaft ausgeschlossen werden

(es wird eine Wahrscheinlichkeitsaussage getroffen; Sicherheit der Aussage hängt von der Anzahl der untersuchten Genorte, dem Polymorphismusgrad der Loci und der Verteilung der Allelfrequenzen ab)

Biologische Abstammungssicherung durch polymorphe Allele

Protein-Polymorphismen (diese Verfahren können in bestimmten Kombinationen eine Vaterschaft ausschließen, nicht aber diese bestätigen)

• Blutgruppen

• Enzym- und Serumprotein-Varianten

• Haupthistokompatibilitätsantigene (MHC-Komplex)

DNA-Polymorphismen

• Mikrosatelliten (STR … Simple Tandem Repeats)

• SNP´s

genetischer Fingerabdruck; DNA-Profil eines Individuums (für dieses in hohem Maße charakteristisch); es werden sehr kleine, immer wiederkehrende, sich oft an einzelnen Loci anhäufende, nicht kodierende DNA-Sequenzen (Mikrosatelliten) mittels PCR vervielfacht. Diese tandemartig wiederkehrenden Sequenzen kommen im Genom aller Säugetiere vor, nur die Anzahl der Wiederholungen sind variabel, d.h. sie treten bei jedem Individuum in unverwechselbarer Länge und Kombination auf; die erhaltenen unterschiedlichen Längen (geschnitten) werden mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und die Bandenspektren verglichen.

anthropologisch – erbbiolog. Gutachten

• mit Hilfe von vererbbaren äußerlichen Merkmalen (z.B. Haut-, Augen-, Haarfarbe, Kopfform, Irisstruktur, etc.)

Tierzucht = Feststellung erblicher Leistungen, Selektion auf Erhaltung bzw. Verbesserung der erblichen Leistung

Abstammung <—> Zuchtwert <—> kommerzieller Wert

Notwendigkeit der gesicherten Zuordnung der Verwandtschaftsverhältnisse

Methoden

• Ohrmarken, Papiere, Herd- bzw. Zuchtbücher (leicht zu fälschen und schwer zu überprüfen)

• Biologische Abstammungssicherung

Marker für Genkarten:

• phänotypische Marker = eindeutig erkennbares Merkmal, das das zu unterscheidende Merkmal markiert, ohne selbst an der Ausprägung des zu untersuchenden Merkmals beteiligt zu sein (z.B. dominante Weißfärbung des Kopfes Fleckvieh = Marker entsprechende Muskelfüllung)

• biochemische Marker = Protein-Polymorphismen (Blutgruppen, Enzyme, Serum-Proteine, MHC...)

• DNA-Marker = anonyme Sequenzen und Gene (RFLP, SSLP, SNP)

Verwendung:

• Kopplungsanalysen (genetische Genkarten, positional cloning)

• Phylogenetische Studien (genetische Distanzen)

• Abstammungsnachweis (väterliche und mütterliche Allele/Nachkommenallele)

• Identitätsnachweis (genetischer Fingerabdruck)

Marker = ‚Markierungspunkte‘ auf den Chromosomen, ohne eigene Funktion bei der Ausprägung des Leistungsmerkmals neutral

• hochpolymorphe DNA-Sequenzen

• DNA-Abschnitte der Gene, deren exakte Lokalisation bereits bekannt ist

• gleichmäßige Verteilung über das Genom

MAS = Marker assisted Selection

• Kopplung von Leistungsgenen mit genetischen Markern (Mikrosatelliten, SNPs = Einzelnukleotid-Polymorphismus)

• Marker = Markierungspunkte auf den Chromosomen, ohne eigene Funktion bei der Ausprägung des Leistungsmerkmals neutral

• Möglichkeiten der Selektion durch Kopplung der Marker mit den Leistungseigenschaften

Grenzen der klassischen Zuchtwertschätzung Einsetzen der MAS

• Merkmal mit niedriger Heritabilität

• späte Ausprägung der Merkmale

• negativ korrelierte Merkmale (Merkmalantagonismen)

Überwinden der Probleme durch Nutzung genetischer Information (MAS)

Vorteile der MAS

• Verkürzung des Generationenintervalls (Selektion VOR der Merkmalsausprägung)

• Erhöhung der Selektionsgenauigkeit durch zusätzliche Genominformation

• Erhöhung der Selektionsintensität durch Einbeziehung einer größeren Tierzahl (mögliche Differenzierung zwischen Voll- und Halbgeschwistern etc.)

Gensonde

Einzelsträngige DNA- oder RNA-Sequenz, die spezifisch markiert ist und an komplementäre Nukleinsäuresequenzen bindet.

Auf Grund der Markierung ist eine Identifizierung der erkannten Sequenz möglich.

Beispiele

bei Southern Blotting

• DNA-Isolierung Gel-Elektrophorese Transfer (Blotting) der DNA auf eine Membran Spezifischer Nachweis von DNA-Sequenzen durch eine Gensonde

bei Hybridisierung

• Gensonde erkennt und bindet Membran-DNA

Mutation = zufällige Veränderung des Genoms durch exo- oder endogene Prozesse, sprunghafte vererbbare Änderung des genetischen Materials

Mutante: minorer Genotyp in einer Population, Abweichung vom Standard

Wildtyp: Genotyp der Wildpopulation bzw. häufigster Genotyp in einer Standard-Population

Genmutation = Veränderung Nukleotidsequenz einzelner Gene oder DNA-Abschnitte, Genmutation betrifft nicht nur Gene: nur 3 % des Säugergenoms ist kodierende DNA von Genen

• Punktmutationen - Substitutionsmutationen (= Basentausch)

• Transition: Purinaustausch (A <-> G) oder Pyrimidinaustausch (C <-> T)
• Transversion: Purin gegen Pyrimidinaustausch (A <-> C, A <->T, G <-> C, G <-> T)

• Deletion = Basenverlust

• Insertion = Basengewinn

Genommutation = Numerische Chromosomenveränderung - Fehlverteilung von Chromosomensätzen oder einzelnen Chromosomen

• Aneuploidie: Verminderung oder Vermehrung des euploiden Chromosomensatzes um einzelne Chromosomen (Monosomie oder Trisomien)

• Euploidie: komplette Vervielfachung des haploiden Chromosomensatzes (Diploidie, Triploidie, Tetraploidie)

Chromosomenmutation = Chromosomenzahl ist gleich, Struktur/Architektur ist gestört - Entstehung durch ungleiches crossing-over (endogen), Rekombination/Fusion während Meiose, exogene Einflüsse (Strahlung)

1. Intra-chromosomal
   • Deletion … Löschen von Abschnitten des Chromosoms
   • Duplikation … ein Abschnitt verdoppelt sich in einem Chromosom
   • Inversion … ein Chromosomenabschnitt bleibt am selben Ort, „dreht“ sich allerdings
2. Inter-chromosomal
   • Insertion … ein Abschnitt geht von einem Chromosom auf ein anderes über
   • Translokation … 2 Chromosomen tauschen Abschnitte aus

Fusionen --> Robertson’sche Translokation = Fusion zweier Zentromere bei telozentrischen Chromosomen an meta- bzw. submetazentrisches abweichendes Chromosom, oft bei Wdk (Rd, Schaf) - Folgen: Fruchtbarkeitsstörungen

Somatische Genom- und Chromosomen-Mutationen  alle euploiden oder aneuploiden Veränderungen der Chromosomenzahl und alle Strukturveränderungen können getrennt oder gemeinsam in Tumorzellen als Folge somatischer Mutationen auftreten (akute myeloische Leukämie, chronische myeloische Leukämie)

Multiple Allelie beruht auf Genmutationen

?

Ursachen von Mutationen:

Endogene Ursachen

• Genom-Fehlverteilung bei der Meiose

• fehlerhafte Chromosomen-Rekombination

• fehlerhafte DNA-Replikation (Synthese)

Exogene Ursachen: Mutagene Wirkungen

• Chemikalisch

Basen-Analoge

Desaminierende Agentien entfernen Amino-Gruppen

Alkylierende Agentien

Intercalierende Agentien

• Physikalisch

UV-Strahlung

Ionisierende Strahlung

Hitze Hydrolyse

Mutagen = chemisches oder physikalisches Agen welches Mutationen hervorruft

• Carcinogene neoplastische Transformation von eukaryotischen Zellen

• Clastogene Fragmentierung von Chromosomen

• Oncogen Induktion der Tumorinformation

• Teratogen Entwicklungs-Abnormalitäten

Chromosomenmutationen = strukturelle Veränderung

• Phänotypisch, erkennbar ggf. erst in einem bestimmten Alter (Robertson‘sche Translokation, Geschlechtsreife)

• Zytologie: Karyogramm

• Chromosomen-Bänderung (versch. Färbemethoden)

• FISH (fluorescence in situ hybridisation)

Genommutationen = numerische Chromosomenaberration

• Phänotypisch

• Zytogenetisch: Karyogramm

Isolierung von DNA aus höheren Organismen

Ausgangsmaterial: kernhaltige Zellen, Organe, Gewebe

1. Zellyse
   • Homogenisationspuffer enthält die Proteinase K
   • Zerstörung des proteinösen Zytoskeletts
   • Freisetzung der Nukleinsäuren
2. Entfernung der unerwünschten Makromoleküle (Protein, Fette , Kohlehydraten) 
   • Extraktion mit Chloroform/Isoamylalkohol
   • exakte Phasentrennung nach Zentrifugation
   • Nukleinsäure in wässriger (oberer) Phase
3. Isolierung /Konzentrierung der DNA (Aussalzen und/oder Alkoholfällung)
   • Zugabe von NaCl zur Endkonzentrierung (vor CHCl₃-Extraktion) und Zugabe von Isopropanol zur Endkonzentrierung von 50%
   • hochmolekulare DNA liegt pelletiert vor

Ausbeute:

• 1g Gewebe oder 10⁹ Zellen (Zellkultur, Leukozyten) ergeben 2mg DNA

• Größe der DNA-Fragmente: 20-120kb (bei Routine DNA-Isolierung)

Epigenetik

betrifft alle Vorgänge, die sich ‘epi’ – d.h. jenseits dieser Grundprinzipien vollziehen und dazu führen, dass die in einem Gen festgelegte (kodierte) Information auch realisiert (exprimiert) wird.

Ursprünglich verstand man darunter die Ausprägung eines bestimmten Merkmals (Phänotyps) des Individuums auf der Grundlage bestimmter Expressionsmuster.

Epigenetik beschäftigt sich mit der epigenetischen Vererbung d.h. der Weitergabe von Eigenschaften auf die Nachkommen, die nicht auf Abweichung in der DNA–Sequenz zurückgehen, sondern auf eine vererbliche Änderung der Genregulation und Genexpression.

Molekulare Mechanismen der Epigenetik

• DNA-Methylierung (Methylierung von C, Methylierte Gene sind in der Regel inaktiviert, weil sie von Transkriptionsfaktoren nicht gebunden werden können)

• Histon-Modifikation (Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung z.B. Heterochromatin zu Euchromatin)

• Kleine und große regulatorische RNAs (RNA Interference, small interfering RNAs, Chromosomen Inaktivierung: XIST = große RNA, es wickelt sich um das X-Chromosom der Frau und inaktiviert es)

genetic engineering (Gentechnik) = Veränderung des Genoms = alle Verfahren, die in einer direkten Veränderung des Genoms eines Organismus resultieren: Gentransfer und Mutagenese

• umfasst alle Techniken, mit deren Hilfe DNA in vitro neu kombiniert und auf einen anderen Organismus übertragen werden kann - im Gegensatz zu früheren Möglichkeiten (z.B. Zucht, Mutation), ist mit Hilfe der Gentechnik der gezielte Eingriff in die DNA möglich. Grundlage ist Universalität des genetischen Codes für alle Lebewesen, schafft Möglichkeiten, DNA über Artgrenzen hinweg zu übertragen.

genetic engineering beim Säugetier bedeutet Embryomanipulation:

Gentransfer - Transgenetik (reverse Genetik) = künstliches Einführen von neuem genetischen Material in die Keimbahn von Tieren

• additiver Gentransfer (gain of function)

• deletiver Gentransfer (loss of function)

• replacement gene transfer (exchange of function)

• somatischer Gentransfer (Gentherapie)

Methoden: 

• DNA-Mikroinjektion

• retrovirale Vektoren

• sperm-mediated gene transfer

• Chimären-Generation

Biotechnik

Nutzung von lebenden Organismen (Mikroorganismen, Pflanzen, Tiere), Kultursystemen oder Biomolekülen für Produktionsprozesse – in vivo, ex vivo, in vitro

Biotechnologie

verbindet Molekulargenetik, DNA Rekombination und Reproduktionstechniken

Transgenesis (Gentransfer)

künstliches Einführen von neuem genetischen Material in die Keimbahn von Tieren

Gentechnik“ in der Veterinärmedizin

Veterinärmedizin

• Diagnose (Krankheitserreger, Patientenprofile)

• Lebens-und Futtermittelhygiene

Tierzucht & Genetik

• Verständnis von Gen- und Genomfunktion

• Gendiagnose (Erbfehler, Leistungsmerkmale)

• Marker-gestützte Selektion

• Identitäts- und Abstammungsüberprüfung

Reproduktionstechniken (kein direkter Eingriff in das Genom)

• Künstliche Besamung

• Synchronisation

• Superovulation

• Embryogewinnung

• Kryokonservierung

• Embryotransfer

• Klonierung (!!! Achtung bei Kern-Transfer erfolgt Veränderung des Genoms)

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