Spektroskopie

ATR kann nur bei einem entsprechenden Einfallswinkel beobachtet werden. Zusätzlich muss ein grosser Dichteunterschied vorhanden sein.

Dies ist eine Welle, die bei ATR aus der Grenzfläche austritt.

Bei Phosphoreszenz, da weniger Energie (durch den Zwischenzustand) vorhanden ist. Weniger Energie bedeutet längerwelligeres Licht.

Strahlungsemission erfolgt immer vom energetisch niedrigsten Elektronenzustand S _1,0 bzw. T _1,0 in den Grundzustand S₀

Emissionsspektroskopie

ATR bedeutet „abgeschwächte Totalreflexion“. ATR kann bei der Probenvorbereitung der IR Spektroskopie verwendet werden.

Es gilt ein erweitertes Lambert-Beer Gesetz, da die Intensität der emittierten Strahlung nicht nu von der Intensität des eingestrahlten Lichts sondern auch noch von der Quantenausbeute abhängt. Die Quantenausbeute ist der Quotient aus emittierten Photonen und eingestrahlten Photonen.

I = Q * I0 * ε * d * c

I = Intensität der Fluoreszenz

I = eingestrahlten Lichtes

Q = Fluoreszenzausbeute

ε = molarer Ektinktionskoeffizient

D = Schichtdicke

C = Stoffmengenkonzentration

• Strahlungsdauer (Lebensdauer)
• Die maximale Wellenlänge (λ_max)
• Wo liegt die Wellenlänge der Emission (λ_Emission)?
• Quantenausbeute, je höher desto besser

Für ein Fluoreszenzspektrometer benötigt man zwei Monochromatoren.

Mit der Xenonbogenlampe wird über den ersten Monochromator die Probe schmalbandig beleuchtet. Dadurch wird sie zur Fluoreszenz angeregt. Das emittierte Licht (Rotverschiebung) fällt auf den zweiten Monochromator, wird dort aufgespalten und detektiert. Das Anregungsspektrum wird dabei herausgefiltert. Die Photomultiplier dienen zur Quantifizierung der Absorption durch die Probe und der Fluoreszenz.

Als Lichtquelle dient eine Deuteriumlampe, deren Licht durch einen Monochromator
aufgespalten wird. Dies geschieht, damit die Probe mit derjenigen Wellenlänge bestrahlt
wird, bei der sie am meisten Absorbiert (λmax). Ein erster Detektor befindet sich
also im 180°-Winkel zur Probe. Bevor das Licht auf die Probe trifft passiert sie ein
Quarzfenster um eventuelle IR-Strahlung herauszufiltern. Die durch die angeregten
Probemoleküle emittierte Strahlung wird in einem Winkel von kleiner 90° zur Einstrahlungsrichtung
gemessen, damit die Messung nicht durch transmittierte Strahlung verfälscht
wird.4) Emittiert wird nicht nur eine bestimmte Wellenlänge sondern ein gewisser
Wellenlängenbereich. Um mit höchstmöglicher Sensitivität zu messen, passiert die
emittierte Strahlung nochmals einen Monochromator. Als Detektoren dienen Photomultiplier.

Quantenmechanik.

Die Spinmultiplizität gibt an in wie viele Raumrichtungen sich der Spin-Vektor einstellen kann. Dabei gibt es Singulett, Dublett, Triplett, Quartett. Die meisten Moleküle befinden sich im Grundzustand im Singulett.

Dies ist eine Änderung von einem elektronisch angeregten Zustand in einen anderen ohne Spinumkehr.

Bei der Fluoreszenz wird ein Elektron in der äusseren Schale durch Lichteinstrahlung angeregt, dabei bleibt der Spin gleich. Das Elektron verweilt eine Weile im angeregten Zustand bis es die zugeführte Energie in Form von Licht wieder abgibt. Dabei ist die Wellenlänge entweder gleich oder länger als beim zugeführten Licht.

Bei der Phosphoreszenz wechseln Elektronen durch Bestrahlung in ein höheres Energieniveau (Quantensprung). Nach einer kurzen angeregten Zeit kommt es zu einem weiteren Quantensprung, während sich der Spin der Elektronen ändert. (Intersystem Crossing). Die so gewonnene Energie kann nicht abgegeben werden, da eine Umkehrung des Spins verboten ist. Das Elektron ist sozusagen in diesem Zustand gefangen. Dabei kommt es erneut zu einem Intersystem Crossing, was den Spin wieder umkehrt aber das Elektron noch weiter anregt. Dies ist eher selten. Aus diesem Grund dauert das Leuchten bei der Phosphoreszenz an, da die Elektronen in ihren angeregten Zuständen gefangen sind.

Fluoreszenz funktioniert nur während der Zeit der Bestrahlung. Phosphoreszenz findet auch danach noch statt.  F und P unterscheiden sich auch bei der Art der Elektronenübergänge während der Relaxation.
Singulett 1,0 --> Grundzustand Fluoreszenz
Triplett 1,0 --> Grundzustand P
Bei P findet Intersystem crossing statt (Spin wird geändert).

1500 – 4000:     Valenzschwingungsbereich, Bindungslängen, Funktionelle Gruppen

100 – 1400:       Gerüstschwingungsbereich, Identität des Moleküls, „Fingerprintbereich“

X-Achse: Wellenzahl

Y-Achse: Durchlässigkeit %

Elektronenstossionisation EI17)
Bei der EI wird nach dem Prinzip des Kathodenstrahloszillographen ein Elektronenstrahl erzeugt. Die Elektronen kollidieren mit den Analytmolekülen im Analytdampf, wobei Elektronen aus den Molekülen herausgeschlagen werden. Die äusserst geringe Masse des Elektrons bewirkt nur kleine Translationsbewegungen (01: 0 = 3), die hohe kinetische Energie ( = 1/236) bewirkt allerdings hohe Rotations- und Schwingungszustände der ionisierten Moleküle. Dies bewirkt Fragmentierungen der Moleküle meist an deren Schwachpunkten. Über die Fragmente können Informationen über die Molekülstruktur gewonnen werden. Die Methode eignet sich jedoch nur für unzersetzt verdampfbare Molekühle geeignet (GC).
 

Bei der chemischen Ionisation werden Ladungen indirekt über ein geladenes Kollisionsgas (CH4, NH3, Isobutan) übertragen. Die Ionisation des Reaktangases geschieht ebenfalls mittels Kathodenstrahl. Das Reaktangas wird gemischt mit dem Analytdampf in die Kollisionskammer überführt. Das Verhältnis beträgt dabei 1:100 – 1:1000, weswegen vorwiegend nur die Reaktangasmolküle ionisiert werden. Das Ionisierte Reaktangas überträgt anschliessend seine Ladung über Protonen- und Hybridübertragung auf die Analytmoleküle. Die Fragmentierung ist äusserst gering, womit vor allem Molekülionen detektiert werden. Die Methode eignet sich also gut zur Bestimmung von Molmassen leicht verdampfbarer Analyten (Einsatz als GC-Detektor).

siehe Bild

Nur bei unzerstörbar verdampfbaren Analyten, d.h. bei der GC.

Der gelöste Analyt wird über eine feine Düse versprüht. Zwischen Düse und einer Gegenelektrode besteht ein Spannungsfeld, das die Analytlösung durchdringt. Dadurch werden die bei der Versprühung entstandenen Tröpfchen positiv ionisiert. Durch ein warmes Inertgas (N2) wird das Eluiermittel verdampft. Durch das Verdampfen des Eluiermittels werden die Tröpfchen immer kleiner und die Ladungsdichte auf der Oberfläche immer grösser. Ist die Ladungsdichte zu gross, zerplatzt der Resttropfen und die Ladungen werden auf die Analytmoleküle übertragen. Dabei werden, im Gegensatz zur EI oder CI auch Mehrfachladungen übertragen. Diese Ionisierungsmethode eignet sich besonders in Kombination mit einer HPLC-Anlage (Eluent+Analyt). Die Fragmentierung ist gering, weshalb der Hauptausschlag im Spektrum die Molmasse anzeigt

Durch das Trocknen eines mehrfach geladenen Tröpfchens kommt es zu einer Erhöhung der Ladungsdichte, die mit einer Abnahme des Tröpfchenradius einhergeht.
Wird die Ladungsdichte zu gross, stossen sich die Ladungen ab, was das Tröpfchen
zerplatzen lässt. Es entstehen weitere sehr kleine geladene Tröpfchen mit wenigen nm
Durchmesser.

Das Eluiermittel sollte leicht verdampfbar sein und die Flussrate muss der Ionisierungsmethode
angepasst werden.

Quadrupole eignen sich nicht zur Analyse von so hohen Molekülmassen (nur bis etwa
3000 D). Also sollte man hier entweder ein stark fragmentierende Ionisierungsmethode
wählen oder eine, die sehr viele Ladungen überträgt.
Fragmentierende Ionisierungsmethoden wie EI kommen hier aber nicht in Frage, da es
sich hier wohl um ein Protein handelt. Proteinen lassen sich aber nicht mit einem GC
auftrennen, was die Voraussetzung für die EI wäre. MALDI und FAB kommen auch
nicht in Frage, da sie nicht für den richtigen Massenbereich einsetzbar sind (MALDI ab
100000 D, FAB bis 10000 D). Es bleibt also nur noch die ESI mit sehr hoher Spannung
und einem HPLC zur Auftrennung. Mit der hohen Spannung wird versucht, genügend
Ladungen zu Übertragen (ca. 20 Ladungen).

MSn und MS-MS-MS sind Begriffe aus der Massenspektrometrie. Sie bezeichnen die
Untersuchung bzw. Fragmentierung von Tochterionen im Zusammenhang mit der
Strukturaufklärung. MS-MS-MS können nur Tochterionen analysiert werden (mittlerer
MS dient als Kollisionszelle). Mit MSn hingegen können auch noch Fragmente der
Tochterionen untersucht bzw. weiter Fragmentiert werden. Dazu müssen mehrere
Messungen durchgeführt werden.
Vorgang MSn:
1. Messung
Durch EI wird fragmentiert und das ganze Spektrum der Fragmente aufgenommen.
2. Messung
Der Fokus wird nun auf ein bestimmtes Tochterion bzw. Fragment gerichtet. Bei einer
zweiten Messung werden alle Ionen in der Ion Trap gespeichert. Durch Veränderung
der Wechselspannung, die über der Ion Trap anliegt, werden alle Fragmente ausser
dem gewünschten aussortiert.
3.Messung
Das noch in der Ion Trap enthaltene Fragment wird mit einem Kollisionsgas weiter
fragmentiert und wieder das ganze Spektrum aufgenommen. Nun kann wiederum der
Fokus auf ein bestimmtes Fragment gerichtet werden. Soll dieses weiter fragmentiert
werden, müssen die ersten drei schritte wiederholt werden und anschliessend das gewünschte
Fragment weiter durch ein Kollisionsgas fragmentiert werden.
Theoretisch lassen sich damit n Messungen (MSn) durchführen. Wegen der Verdünnung
der Ionen mit fortschreitender Anzahl der Messung liegt die Grenze bei ca. 12
Fragmentierungen.

Mit einer Ion Trap können mehr Messungen bzw. Fragmentierungen (MSn) durchgeführt
werden als mit einem Trippelquadsystem. Damit ist die Analysentiefe dementsprechend
besser, da mit der Ion Trap mehr als einmal zusätzlich fragmentiert werden
kann.

Parent Ions sind diejenigen Ionen bzw. Fragmente, die in der Ionenquelle entstehen.
Daughter Ions entstehen erst nach einer weiteren Fragmentierung mittels Kollisionsgas
in einem Trippelquad oder einer Ion Trap.

Ein Multi Channel Plate-Detektor (MPC) funktioniert nach dem Prinzip des SEV (Sekundärelektronenvervielfacher). Dabei sind mehrere SEV-Einheiten zusammengebaut, was die Sensitivität erhöht und eine räumliche Auflösung ermöglicht. Der Ionenstrahl trifft dabei in einen kleinen Kanal, der mit einem Halbleiter beschichtet ist. Die auftreffenden Ionen schlagen dabei weitere Elektronen los, die an anderer Stelle wiederrum weitere Elektronen herausschlagen. Die Anzahl Elektronen wächst dabei lawinenartig an, was zu einem sehr starken Endsignal für jedes detektierte Ion führt. Ein Kanal entspricht dabei einem SEV.

Die Matrix bildet bei der Ionisation ein Plasma, über welches die Ladungen auf die
Analytmoleküle übertragen werden. Sie besteht aus einem Chromophor, der bei einer
bestimmten Wellenlänge Licht absorbiert. Der beim MALDI eingesetzte LASER strahlt
genau mit dieser Wellenlänge ein.

Bei der Matrix Asocieted Laser Desorption/Ionisation wird die Probe in eine Matrix aus
Sinapinsäure oder Dihydroxibenzoesäure eingebettet. Die Analytmoleküle müssen dabei
Teil des Kristallgitters sein.

TOF bedeutet Time Of Flight. Die unterschiedlichen Ionen werden durch eine Pulsquelle
beschleunigt, wobei sie alle die gleiche kinetische Energie erhalten. Anschliessend
legen sie eine definierte Flugstrecke zurück, an deren Ende der Detektor sitzt. Schwerere
Ionen gelangen dadurch verspätet zum Detektor, leichtere früher da sie um, die
gleiche kinetische Energie zu besitzen, eine höhere Geschwindigkeit haben müssen

Das Reflektron besteht aus mehreren Ionenspiegeln, die geringe Geschwindigkeitsdifferenzen
zwischen gleichen Ionen durch Spiegelung ausgleichen. Damit wird die Auflösung
erhöht. Zum Einsatz kommt dieses System im Massenseparator eines MALDISpektrometers.

Die Auflösung ist definiert als: R = m/ Δm
Die Auflösung ist gut wenn die Ausschläge basisliniengetrennt sind.

Die Genauigkeit ist definiert als:
D_m = m_real- m_measured
Die Genauigkeit ist gut, wenn die Differenz gegen Null geht.

Die verschiedenen Ionen bzw. Fragmente befinden sich eingeschlossen in einem Spannungsfeld,
das von einer Wechselspannungsquelle gespeist wird. Durch kurzzeitige
Schwankungen der Wechselspannung (Pulse, Dauer: 0.1 s) werden Ionen nach m/z
aussortiert

Die Ion Trap deckt einen Massenbereich bis 40'000 m/z ab.
Für die Analyse grosser Biomoleküle bietet sich MALDI oder ESI an.

Bis 3000 m/z.