Histolügie

• Bei schwerflüchtigen Substanzen.
• Bei polaren, unpolaren oder ionischen Substanzen.
• Wenn Probenmaterial GC-und LC-Säulen beschädigen würde.
• Wenn Detektion mit GC und LC nicht möglich oder sehr aufwändig wäre.
• Wenn auch nach der Chromatographie alle Probenbestandteile erkennbar sein müssen (z.B. an Start oder Front).

Anwendungsgebiet speziell:

• Porphyrin-Nachweis
• Wirkstoffe und Metabolite in biolog. Matrices
• Drogenscreening
• Stoffwechseldefekte bei Babys
• Pestizid/ Fungizidbestimmungen (Trinkwasser, Lebensmittel)
• Grundwasseranalytik
• QC Pharmaindustrie
• Parfüminhaltsstoffe
• Anorg. Ionen
• Galvanotechnik
• Wenn keine Elektrische Energie vorhanden.

Laufstrecke 5-15 cm

Trennstufenzahl 500 bis 3000

Laufzeit 10-30 min.

Ohne Kammersättigung (Problem der nicht konstanten FM-Zusammensetzung)

Mit Kammersättigung (besser reprodzierbare Rf-Werte)

• Entwickeln und Trocknen
• Finale Position wir durch den Retentionsfaktor (R_f)-Wert erfasst
• R_f beschreibt Laufverhalten
  • Die Lösungsmittelfront wandert nicht immer gleich weit.

R_f= Entfernung Startpunkt - Analyt (Sx) / Entfernung Startpunkt - Lösungsmittelfront

Qualitativ: Rf-Werte, Farbe, UV-Verhalten, mehr Information durch Kopplung mit spektroskopischen Verfahren.

Halbquantitativ (nur mit den Augen): Intensität der Farbe, Intensität des UV-Verhaltens, grösse der Substanzflecken (Verdünnungsreihe).

Quantitativ (mit technischer Unterstützung): Streifenweises Scannen der UV/Vis-Absorption, erhaltene Peaks analog zur Säulenchromatographie auswertbar, Kalibrier- und Analysenfunktion nutzbar, einzelnes Extrahieren der getrennten Substanzen und anschliessend spektroskopisches Verfahren.

Rf-Werte sind immer nur Richtwerte (Konzentrationsabhängig). Immer Standard vergleichbarer Konzentration mitlaufen lassen. Bei sehr unregelmässigen Flecken Rf-Bereich angeben. Brauchbare Rf-Werte liegen zwischen '0.2 und 0.8

• Eigenfarbe
• Fluoreszenz
  • bei Tageslicht
  • durch Anregung mit UV
• Fluoreszenzminderung: erfordert Fluoreszenzindikator
• Chemische Farbreaktion (-> Sprühreagentien)
  • I₂(Lösung oder Dämpfe): braune Flecken bei basischen N-Verbindungen
  • KMnO₄: weisse Flecken auf rosa Grund bei reduzierenden Verbindungen.
  • Dragendorff-Reagenz: orange-gelbe Flecken bei Alkaloiden
  • FeCl₃: zart-violette Flecken bei Phenolen (int. grün bei 1,2-Diphenolen)
  • Ninhydrin: blauviolette Flecken bei Aminosäuren.

Pros: einfach, geringer apparativer Aufwand, geringe Kosten, hohe Trennleistung, hohe Selektivität, geringer Zeitaufwand

Cons: Standards sollten mitlaufen, Laufmittel kann nicht gewechselt werden, Geschwindigkeit nicht beeinflussbar, kaum quantitative Aussagen.

Trennleistung hoch bei kleinem Partikeldurchmesser und enger Korngrössenverteilung

vorwiegend verwendet werden:

• Siliziumoxide
• Aluminiumoxide
• Kieselgur
• Chem. modifiziertes Kieselgel
• Cellulose
• Polyamid
• Magnesiumsilicat

unpolare stationäre Phase, polare mobile Phase

Die stationäre Phase ist hydrophob, die mobile Phase ist Wasser bzw. Wasser/ Alkoholgemisch.

Beispiel: C-Ketten-Modifikation mit Alkylsilanen.

Träger der Substanz über die stationäre Phase, wobei die Wechselwirkung der Probenmoleküle mit dem Fliessmittel grösser ist als mit der stationären Phase => Elution.

Auswahl mittels elutropen Reihe: polar zu unpolar (Wasser, Methanol, Ethanol, Pyridin, Dimethylsulfoxid, Ester, Ketone, ... Alkane.

Anforderungen: Genügende Reinheit, Stabilität, geringe Viskosität, geeigneten Dampfdruck, möglichst nicht giftig

• Stationäre Phase
  • Aktivität
  • Korngrösse
  • Korngrössenverteilung
  • Bindemittel
• Mobile Phase
  • Verunreinigungen
• Kammer
  • Kammertyp
  • Sättigung
• Weitere Einflussgrösse
  • Fleckgrösse bei der Auftragung
  • Abstand Start-Lauftmittel
  • Trennstrecke
  • Temperatur
  • Luftfeuchtigkeit

• Beschriften mit Bleistift
• Kammer vor Zugluft schützen
• keine direkte Sonneneinstrahlung (-> unregelmässige Fronten)
• Kammersättigung anstreben (-> vergrösserte Rf-Werte)
• Substanzmenge anpassen (-> Tailing bzw Rf>0.2)
• DC-Platten vor Laborluft schützen

Höhere Trennstufenzahl

Das innere Chromatogramm

Nach Korngrösse und Polarität

• Auftrennung durch Flüchtigkeit und die Wechselwirkung mit der stationären Phase. 
• Anwendungsgebiete in der klinischen Chemie:
  • Forensische Bestimmung von Ethanol und anderen flüchtigen Stoffen. 
  • Toxikologisches Screening. 
  • Quantifizierung von Medikamenten und Drogen aus Blut. 
  • Quantifizierung von Fettsäuren und Aminosäuren. 
  • Diagnostik von Vitaminen und Spurenelementen. 

Die stationäre Phase enthält meist eine flüssige, thermostabile Substanz (Gasflüssigkeitschromatographie, z.B. Silikonöl, Paraffine) -> Verteilung.

Seltener sind feste stationäre Phase (Gasfeststoffchromatographie, Aktivkohle, Kieselgel) -> Adsorbtion.

• Mobile Phase ist inertes Gas (HE, H₂, N₂)
• Analyt (organisch, anorganisch) gasförmig -> verdampfbare Verbindungen
• Trennsäule im Säulenofen

1. Probeneinbringung ins System (Split/ Splitless, Headspace,...). 
2. Verdampfung unter Wärme. 
3. Transport zur Säule mittels Trägergas. 
4. Auftrennung. 
5. Detektion. 

Gepackte Säulen und Kapillarsäulen. Für ätherische Öle sind Kapillarsäulen besser geeignet.

Pros für Kapillarsäuelen: Hohe Trennstufenzahlen, geringe Anforderungen bzgl. Selektivität -> universeller einsetzbar.

Cons: Geringe Belastbarkeit, empfindlich gegenüber Kontaminationen.

Kapillarsäulen bestehen aus Quarzkapillaren mit 15-60 m Länge, 0.1-0.75 mm Innendurchmesser, die innere Wandung ist beschichtet mit Trennflüssigkeit.

Die Faustregel bei der Säulenauswahl: Gleiches löst Gleiches, polare Phasen für polare Analyten.

Hauptsächlich Helium. N₂ und H₂ weniger, da He besser ist als Stickstoff und weniger gefährlich als Wasserstoff. Die Bodenhöhe variiert je nach Gas. He und H₂ sich breiter, wodurch die Strömungsgeschwindigkeit weniger wichtig ist. Das Optimum von He und H₂  verschoben -> schnellere Analysezeiten.

• Thermisch labile Substanzen zersetzen sich.
• Polare Substanzen können irreversibel adsorbieren.
• Hervorragende Analysentechnik für viele Analysen.
• Trennleistung und Empfindlichkeit sehr gut.

• Zahlreiche schmale Peaks nebeneinander
• Bestimmung des Retentionsindex nach Kovats
• Für qualitative Fragestellungen Datenbanke (z.B. NIST bei Kopplung mit MS)
• Standards!

• Definiertes Retentionszeitintervall wird von 1. Säule auf gekühltes Interface überführt -> Fokussierung der Komponenten.
• Schnelle Injektion in 2. Säule
• Schnelle Chromatographie in 2. Säule

• Prozess zur Modifizierung von Analyten.
• Erhöhung der Flüchtigkeit.
• Verbesserung der Detektierbarkeit

Was müsste man tun um eine polare Substanz flüchtig zu machen? Polarität entfernen. Polare Gruppen wie OH-, NH, SH- werden überlagert womit die Polarität entfernt wird.

Differenzielle Messungen in MZ (Messzelle) und VZ (Vergleichszelle), wobei die Wärmeleitfähigkeit des Messgases gemessen wird.

Die Temperaturänderung ändert den elektrischen Widerstand in den Heizdrähten, der als Signal detektiert wird.

Pros: Einfach. Zerstörungsfrei. Grosser dynamischer Bereich. 

Cons: Vergleichsweise hohe Nachweisgrenze. He oder H₂ als Trägergas.

Der Analyt wird in einer Flamme ionisiert, wodurch dann ein messbarer Strom fliessen kann. H_{2 und Luft führen zu kontrollierten Verbrennung. Wenn nur Trägergas ankommt kann kein Strom fliessen. Werden ionisierbare Verbindungen verbrannt kommt es durch e^- zum Strommfluss, die an der Anode gesammelt werden.}

_{Pros: Sehr empfindlich für Kohlenstoff-Verbindungen. Robust. Grosser dynamischer Bereich.}

_{Cons: Brenngas nötig. Der Analyt wird zerstört.}

Beschichtetes Blech als beta-Strahler ionisiert das Trägergas. Die langsamen Elektronen werden an der Sammelelektrode (Anode) eingefangen. Kommen keine Verbindungen an fliesst Nullstrom. Kommen Moleküle im Trägergas an, die Elektronen einfangen können, gelangen weniger Elektronen zur Sammelelektrode, was erfasst wird.

Pros: Sehr empfindlich für elektronegativen Gruppen.

Cons: Kein dynamischer Bereich.

Trennung durch Adsorption und Verteilung zwischen mobiler und stationärer Phase.

Normal Phase: Stationäre Phase polar, Laufmittel apolar (Toluol oder Hexan), Trennung unpolarer Substanzen.

Reversed Phase: Stationäre Phase apolar, Laufmittel polar, Trennung komplexer Substanzgemische (breite Spannweite an Polarität).

Polarität bezeichnet eine Ladungsverschiebung in Atomgruppen. Die Atomgruppe ist elektrisch nicht mehr neutral.

• Retention innerhalb einer Mischung steigt mit der Polarität des Analyten.
• Silikagel als stationäre Phase, -Si-OH-Gruppen.
• Adsorption durch Dipol-Dipol- Wechselwirkung.
  • Permanenten Dipol oder Silanol-Gruppe und ein permanent induzierter Dipol am Analyten.
• Elutionsmittel
  • Schwach: Pentan, Hexan
  • Mittel: Chloroform, Dichlormethan
  • Stark: Propanol, Methanol

Faustregel: Polare Stoffe werden später eluiert als unpolare. Retention im unpolaren Lösungsmittel. Elution durch polares Lösungsmittel.

• Ideal zur Analyse unpolarer Substanzen.
• Weit verbreitet.
• Stationäre Phase: Silikagel mit chemischer Modifikation (C18) →unpolar.
• Van-der-Waals Wechselwirkungen →Trennverhalten stark vom Lösungsmittel abhängig.

Faustregel: unpolare Stoffe werden später eluiert als polare. Retention im polare Lösungsmittel. Elution durch unpolares Lösungsmittel.

Laufmittelzusammensetzung bleibt konstant.

Vorteil: Schnelle Trennmethode. Kein Äquilibrieren der Säule zwischen den Trennungen.

Nachteil: Schlechtere Trennung.

Laufmittelzusammensetzung wird während der Trennung geändert.

Vorteile: Schärfere Peaks. Bessere Trennung. Gut geeignet um optimale Bedingungen für isokratische Trennung zu finden.

Nachteil: Zeitaufwändiger. Re-Äquilibrieren der Säule notwendig.

High-Performance-Liquid-Chromatography

Weiterentwichlung der Säulenchromatographie. Mit abnehmbarer Teilchengrösse steigt der erforderliche Druck exponentiell an, wodurch die alleinige Schwerkraft nicht mehr ausreicht. Die mobile Phase muss also mittels geeigneter Vorrichtung unter Druck gesetzt werden (20-200 bar).

Die geringe Teilchengrösse in der stationären Phase (5-50µm, 50-500 m²/g) bewirkt eine wesentliche Steigerung der Trennstufenzahl pro Säule gegenüber klassischer Säulenchromatographie (50000 bis 100000 Trennstufen pro Meter). Typische Säulenlänge 12.5 cm heisst ca. 10000 Trennstufen pro Säule. Säulen sind aus Stahl, haben einen Innendurchmesser von 1 bis 4mm und sind 5 bis 50 cm lang.

• normal Phase: Dipol-Dipol-Wechselwirkung durch zum Beispiel funktionelle Gruppen.
• reversed Phase: Dispersionseffekt, schwächste Dipol-Dipol-Wechselwirkungen.