Histolügie

Der verwendete Detektor bestimmt die Reinheitsanforderungen an die Eluenten.

Bei UV-Detektoren muss das Laufmittel eine geringen Eigenabsorbtion und geringen Gehalt an UV-aktiven Stoffen haben. HPLC-grade.

Beim Fluoreszenz-Detektor muss das Laufmittel eine geringe Eigenfluoreszenz bei den gewählten Exitations und Emissionswellenlängen.

Weitere Anforderungen:

• Hohe Reinheit.
• Kompatibilität der Komponenten untereinander.
• Vollständige Löslichkeit der Analyten.
• Transparent für Licht bis etwa 200 nm.
• Stabilität in abnehmbaren pH-Bereich und hohem Druck.

RP-HPLC meist hydroorganische Gemische (Wasser, Acetonitril, Methanol).

NP-HPLC Gemische unpolarer Lösungsmittel mit geringer Menge polarer organischer Lösungsmittel (Hexan, Heptan, mit Ethern, Alkoholen).

Die Probe sollte im Eluenten gelöst werden, beziegungsweise in der Anfangszusammensetzung des Gradienten, oder in einem weniger starken Eluenten.

Der pH der  Probe sollte insbesondere bei protonierbaren Analyten dem des Eluenten entsprechen.

Ist die Probe in einem stärkeren Eluenten gelöst, führt dies zur Schulterbildung im Massenspektrum.

Erhöhte Temperatur führt zu verringerter Retentionszeit (Laufmittel kann eingespart werden).

Weiter braucht es einen weniger hohen Systemdruck, weil die Viskosität abnimmt.

Nachteil ist, dass das Säulenmaterial und die Analyten höheren Belastungen ausgesetzt sind.

• Selektivität hängt von stationären und mobilen Phasen ab.
• Stofftransport in flüssiger Phase ist langsamer als in Gasphase.
• Substanzlimit GC. Analyt muss sich bei 400°C unzersetzt verdampfen lassen.

Weitere Verbesserung der HPLC. Der höhere Druck lässt eine geringere Partikelgrösse <2µm zu (HPLC 3 bis 10µm). Dadurch werden schnellere Analysen bei gleichbleibender Trenneffizienz erreicht. Es kann Lösemittel eingespart werden und ein geringeres Probenvolumen ist nötig.

Bis 1300bar im Gegensatz zur HPLC nur bis 600bar.

Partikel der Säule sind möglichst gleich gross, wodurch die Eddy-Diffusion verringert wird.

• Engere Partikelgrössenverteilung.
• Erweiterte Oberflächenbeschaffenheit.

Weniger Longitudinaldiffusion. Der Solid Core ist undurchdringlich für Analyten und das Gleichgewicht kann sich schneller einstellen.

Anwendung Van Deemter.

Size Exclusion Chromatography.

Trennt nach Molekulargewicht. Unterschieden wird die Gel-Permeationschromatographie (organisches Lösungsmittel) und die Gel-Filtrationschromatographie (Wässrige Lösungsmittel). Es kommt zu keinerlei kräftebasierender Wechselwirkung zwischen Analyt und stationärer Phase.

Kleinere Moleküle legen längere Wegstrecken durch die poröse Matrix zurück als grössere.

Die Packung besteht aus Polymerkügelchen, Kieselgel oder porösen Glasteilchen.

Gross geht durch, klein bleibt hängen.

Ion Exchange Chromatography.

Basis bildet die unterschiedliche Affinität von Ionen zu den entgegengesetzten geladenen ionischen Zentren der hydrophoben stationären Matrix. Die hydrophobe Matrix besteht aus einem Co-Polymer von Styrol und Divinylbenzol.

Die Retention hängt stark von pH-Wert und Ionenstärke der wässrigen mobilen Phase ab.

Abhängig von der Ladung der ionischen Zentren. Kationen oder Anionenaustauscher.

Trennung ionischer Substanzen. Ionische Probemoleküle werden durch ein Gegenion maskiert.

Die mobile Phase enthält einen ionischen Zusatz, der mit der entgegengesetzten geladenen Probenkomponente im Ionenpaar bindet.

Die Ionenpaare wirken nicht ionisch. Die Trennung findet über reversed Phase statt, womit die Trennung von Säuren, Basen und Neutralstoffen ermöglicht wird. Eine Ionensorte wird maskiert und durch die Wahl des entsprechenden pH-Wertes unterdrückt.

Biospezifische Wirkung zwischen kovalent an Packungsmaterial gebundene Gruppe und Analyt.

Schlüssel Schloss Prinzip.

Hoch spezifische Chromatographie zum Beispiel Immunoaffinitäts-Chromatographie mit Ag/Ak.

Wird oft für Proteinaufreinigung genutzt. Die Elution wird durch pH-Wert Änderung oder displacer Moleküle hervorgerufen.

Häufig eingesetztes Detektionsverfahren, wobei der Analyt ausgeprägte Absorptionseigenschaften im Wellenbereich von 200 bis 900 nm aufweisen muss.

UV Vis ist sehr gut zur quantitativen Bestimmung. Die Empfindlichkeit liegt im nmol Bereich.

Der Analyt hat eine Eigenfluoreszenz oder wird durch Derivatisierung fluoreszierend gemacht. Voraussetzung ist ein deutlicher Unterschied der Anregungswellenlängen zur Emissionswellenlänge. Die Empfindlichkeit liegt im pmol Bereich.

Massenspektrometrie ist ein Analyseverfahren zur Bestimmung chemischer Elemente oder Verbindungen. Sie gibt Aufklärung zur Struktur und Zusammensetzung von Verbindungen und Gemischen. Der qualitative und quantitative Nachweis sehr kleiner Substanzmengen (10-15 femtogramm) ist möglich.

Analysiert werden Ionen in Gasphase anhand ihrem Masse zu Ladung Verhältnis.

Die m/z gibt Aufschluss über:

• Elementzusammensetzung.
• Molekülmasse.
• Doppelbindungen.
• Struktur.

1. Einlasssystem.
2. Ionenquelle.
3. Analysator.
4. Detektor.
5. Datensystem.
6. Hochvakuumpumpen.

• Electron Impact EI.
• Chemische Ionisation CI.
• MALDI Matrix assisted laser desorption ionisation.
• Electrospray Ionisation ESI.

• Magnetfeld.
• Time of flight TOF.
• Quadrupol.
• Ion Trap.
• Fourier Transform.
• Ion Cyclotron Resonanz.

• Multichannelplatte.
• Conversionsdynode (SEV).

Electrospray Ionisation.

Sanfte Ionisierung, die auf Desolvatisierung gelöster Ionen im elektrischen Feld bei Atmosphärendruck beruht.

1. Bildung geladener Tröpfchen.
2. Lösungsmittelverlust.
3. Ladungsdichte nimmt zu.
4. Coulomb Explosion.
5. Bildung von Mikrotröpfchen, komplette Desolvatisierung.

Durch Anlegen einer Hochspannung an die ESI Kapillare kommt es zur Ladungstrennung und es bildet sich der Taylor Konus. Es werden kleine Tröpfchen mit positiver Überschussladung emitiert. Stabilitätsgrenze ist das Rayleigh-Limit.

Atmospheric pressure Chemical Ionisation.

Atmosphärendruck Variante der CI. Eluat aus HPLC mit hoher Temperatur und Gasfluss verdampft. Die Koronanadel erzeugt Ionen aus den Analytmolekülen.

Matrix assisted laser desorption ionisation.

Probe wird in Matrix (Co-Kristalisation) mit kurzen UV-Laserimpulsen 3-5ns, 337nm, 107W/cm2 beschossen.

Mechanismus: Kombination aus Desorption und Ionisierung. Wahrscheinlich durch sehr schnelle Relaxation der Anregungsenergie aus den Matrixmolekülen ins Festkörpergitter.

Produktion von M+H, M+Na, M+K, M-H

Optimale Massenauflösung: Laserenergie nahe Schwellenergie für Ionisierung.

Matrix schützt den Analyt.

besteht aus aromatischen Verbindungen (Doppelbindungen), da diese viele Energie absorbieren können und den Analyten schützen.

4 parallel hyperbolische Stabelektroden an die Gleich- und Wechselstrom angelegt wird.

Durch die wechselnde Ladungsfelder entstehen, lassen Ionen in kreisförmigen Bahnen passieren.

Nur Ionen mit bestimmter m/z ratio können passieren und erreichen den Detektor. Auflösung maximial 5000.

Ist ein Analysator von dem es 2 Typen gibt. Die Lineare Ionenfalle und die 3D Ionenfalle.

Der Analysator hat eine niedrige Auflösung, die mit der Geschwindigkeit abnimmt. Mehrfache Fragmentierung (MS3, MS4, MSn) sind möglich, daher gut für Identifizierung.

Der Ion Trap Analyzer hat keinen grossen linearen Bereich, daher suboptimal für Quantifizierung, ist aber Preisgünstig.

Ionen tiefer Konzentration können in der Ionenfalle Akkumuliert werden und dann zusammen zur Detektion geschickt werden. Der Auswurf kann axial oder radial erfolgen. Ionen im Quadrupol langsam, wodurch der Ionenstrom erliegt. Trapping Potential in der z-Achse. Für das Kühlen der Ionenfalle wird inertes Puffergas verwendet.

Ionenfallen leiten, akkumulieren und setzen Ionen wieder selektiv frei.

Auch als Quadrupol Ionenfalle oder Paul Trap bekannt.

Endkappenelektroden sind miteinander verbunden. Eine Ringelektrode ersetzt die Quadrupolstäbe. Durch Spannungen werden gewisse m/z Bereich gezielt stabil gehalten. Ionen werden durch Puffergas (He) thermalisiert. Coulombsche Abstossung beschränken die Füllung der Falle. Nicht sehr gut geeignet für quantitative Messungen.

Ionenfalle ohne Magneten oder Rf-Anregung. Detektion Frequenzen die indirekt zur Masse proportional sind. Umwandlung mittels Fourier Transformation. Elektrostatische Felder zwingen Ionen auf kreisförmige Bahnen um zentrale Spindelelektrode. Die Bewegung wird dann von äusseren Elektroden detektiert. Sehr hohe Auflösung.

Time of Flight. Ionen werden im elektrischen Feld beschleunigt und treffen zu unterschiedlichen Zeiten auf den Detektor. Unterschiedliche m/z führen zu verschiedenen Geschwindigkeiten. Schwerer Ionen brauchen länger als leichtere.

m/z ist proportional zur Flugzeit t².

Typische Flugzeiten im µsekunden-Bereich.

Im Aufbau gibt es das lineare Flugrohr und das Flugrohr mit Reflektor das Fehler in der Flugzeit ausgleicht und die Auftrennung verbessert.

• Abschirmungseffekt der Ionen.
• Dispersion durch Coulomb-Abstossung.
• Dispersion durch Kollision der Ionen.
• Zeitdispersion.
• Zeitunterschied mit der zwei identische Ionen in der Dauer eines Laserpulses bei MALDI gebildet werden, bleibt konstant während der gesamten Flugzeit.
• Raumdispersion.
• Ionen werden an unterschiedlichen Orten der Ionenquelle gebildet.
• Energiedispersion.
• Ionen besitzen Energieverteilung nach Ionisierungsprozess.

Metastabile Ionen sind Ionen die nach der Beschleunigung aus der Ionenquelle in der feldfreien Region zerfallen, bevor sie zum Detektor gelangen.

Metastabile Fragmentierung oder post source decay PSD.

In einem linearen TOF können metastabile  Ionen nicht vom ursprünglichen Precursor Ion unterschieden werden, da ihre Geschwindigkeit unverändert bleibt.

Alle gebildeten Ionen werden Detektiert = hohe Sensitivität.

Die einzige Totzeit ist die Zeit zwischen den Laserpulsen.

Ion schlägt aus Metaldynode Elektron heraus. Elektronenkaskade mittels weiterer Dynoden. Messbares elektrisches Signal.

Milionen von Mikrometer kleinen Electron Multiplier (EM) auf einer Platte. Meist mehrere MCP hintereinander angeordnet.

Detektion grosser oder wenig beschleunigter Massen. Beschleunigung kurz vor der ersten Dynode schlägt mehr Elektronen aus der ersten Dynode.

3 Quadrupole in Serie geschalten.

zweiter Quadrupol als Stosskammer. Q1 und Q3 sind Massenfilter.

Verschiedenste QQQ Scantechniken.