Biotechnologie

Piktieren vor der Reifung ---> Luftkanäle für aerobe Bedingungen.
Pilzsporen von Penicillium roqueforti in der Starterkultur ---> dadurch während der reifung Mycelbildung im Käse-Inneren möglich (blau-grüne Färbung)
bei anaerober Reifung: Verlangsamung des Mycelwachstums, freisetzung von Exoenzymen mit lypolitischer und proteolytischer Aktivität
---> Aroma- und Geschmacksstoffe
----> Abbau der Lipide und Proteine (Aroma)

Mikrobiologisch:
-homofermentative Milchsäuregärung
-thermophile Mischkultur aus: S. thermophilus und        L. bulgaricus ---> SYMBIOSE  


Chemisch-Physikalisch
-Denaturierung der Molkenproteine durch Hocherhitzung der Milch bei etwa 95°C
-Ausflockung des Caseins (bei pH-Wert von etwa 5,3)
-Übergang vom Sol- zum Gelzustand
-pH-Wert sinkt durch die Reifung (warm: 4,7/kühl: 5,0)
---> Abnahme des Süßgeschmacks durch den Lactoseabbau

CO₂: erwünscht, Gasbildung führt zur Lochbildung im Käse oder einem prickelnden Mundgefühl
unerwünscht bei Konserven ---> Bombagen
Acetat und Ethanol führen mit zur Aromabildung

Unvollständige Oxidation durch essigsäurebakterien
Ethanol---> Essigsäure (Acetobacter, Acetomonas)
1. Ethanol---->Ethandiol (Alkoholdehydrogenase)
2. Ethanal---->Essigsäure (Anlagerung von Wasser/mit H₂O)
Störungen: keine ausreichende Luftzufuhr ---> Disproportionierung von Acetaldehyd zu Essigsäure und Ethanol
Keine ausreichende Kühlung
 

Lactobacillus sake
Lactobaciullus curvatus
Lactobacillus plantarum

-pH-Wert-Senkung
---> Stabilisierung der Pökelfarbe
---> Aromabildung
---> Strukturverfestigung
--->Konservierung

Konkurrenzflora
 

Milchsäurebakterien
-Lactobacillus sake
-Lactobacillus curvatus
-Lactobacillus plantarum

Katalase-positive Bakterien:
-Staphylococcus spp.
-Micrococcus spp.
möglicherweise noch bestimmte gramnegative Bakterien

Hefen (v.a. in ungeräucherten Produkten)
-Debaromyces spp.

Schimmelpilze (auf nicht oder nur schwach geräucherten Produkten)
-Penicillium spp.
 

Zeitliche Ablösung der verschiedenen Wirkungsmechanismen. Läuft in der Regel nacheinander ab. Zu beginn hat man noch ein sehr empfindliches Produkt.
Konservierung: Nitrit(pökelsalz), Nitrat
Redoxpotential: Wird gesenkt, durch die Senkung des Sauerstoffgehaltes oder Zusatz von Ascorbinsäure oder Zucker (führt zum Sauerstoffverbrauch durch die aerobe Keimflora)---> Selektionsvorteil für anaerobe Milchsäurebakterien
Konkurrenzflora entsteht durch die Zugabe von Starterbakterien und führt zur Unterdrückung der unerwünschten Keime
Säuregrad: Führt zur senkung des pH-Wertes, dadurch steigender Säuregehalt. Zuckerzusatz als Substrat für die Milchsäurebakterien oder Zusatz von GdL
Wasseraktivität: ist die größte Hürde, abhängig von temperatur und relativer Luftfeuchtigkeit (Wasserentzug durch Verdunstung), Abfall der Wasseraktivität bis zum Reifungsende
 

hergestellt aus Weißkohl unter Milchsäuregärung + Speisesalz. Langsam wachsender Kohl, mit festen Köpfen und dünnen Blattrippen. Die Säerung erfolgt durch natürliche Milchsäuregärung. Zugabe von Zucker, Kräutern und Gewürzen ist zulässig. Verboten ist die Zugabe von Essig, Milchsäure, chemischen Konservierungsstoffen, Bleichmittel, Süßstoffen und anderen Fremdstoffen
Technologie:
Weißkohl: wird für 1-2d angewelkt, dann erfolgt die Entfernung von Strunk und Außenblättern. Schneiden in Streifen von 1-3mm Breite.
Kohl wird dann mit 2-2,5% Kochsalz in den Fermentationsbehälter gegeben und dort eingestampft (homogene Verteilung) und Verdrängung des Sauerstoffs.
Vollständige Bedeckung mit Lake und Zugabe von Kräutern und Gewürzen und evtl Zucker (1-6%) zur Unterstützung der Gärung
luftdichtes Abdecken mit Plastikfolie
Fermentation bei 18-20°C für mindestens 4 Wochen
---> Milchsäurekonzentration etwa 1,5%
pH: 3,6- 3,8 sinkt ab
evt. pasteurisieren---> Haltbarkeit (Konserven)
Ausbeute ca. 50-55% durch den wasserentzug
---> Große belastete Abwassermengen (Kochsalz und organische Verunreinigungen)

1. Phase über 3 Tage
-aerobe Mischflora: Bakterien, Hefen und Schimmelpilze
- Geschmackskomponentenausbildung (Säure, Ester)
- Entstehung von CO2 führt zur Schaumbildung und dem Sauerstoffaustrieb.

2. Phase etwa 3 Tage
-abnehmendes Redoxpotential durch den Sauerstoffverbrauch
-Vermehrt heterofermentative Milchsäurebakterien die den Zucker zu Milchsäure, Alkohol, Essig und CO₂ verstoffwechseln
Konkurrenz: fakultativ anaerobe Enterobacteriacae, anaerobe Sporenbildner
pH-Wert sinkt: milchsäureproduktion, Wachstumshemmung säurelabiler Organismen
Hoher Salzgehalt: Austritt leicht vergärbarer Kohlenhydrate und Selektionsvorteil für salzotolerante Milchsäurebakterien

3. Phase
-Vermehrung säuretoleranter Milchsäurebakterien (Lactobacillus plantarum) und zunehmender Säuregehalt führen zur intensiven Milchsäurebildung

4. Phase
Dominanz von Lactobacillus brevis, wichtig für die Aromabildung
Der Milchsäuregehalt steigt auf 1,5-2%, das führt zu einer Hemmung säuretoleranter Milchsäurebakterien
 

-Sojabohnen7entfettetes Sojamehl + Weizen + Kochsalz + Starterkultur (gekochter Reis beimpft/bebrütet mit: Aspergillus oryzae oder Aspergillus soyae)
1. Schritt Herstellung von Koji
-Starterkultur wird zu geröstetem Weizenschrot und eingeweichten/eingedampften Sojabohnen gegeben. Verhältnis Weizen : Soja etwa 1:1
-Verpilzung für 72h bei 27-37°C führt zur Vermehrung der Pilzkulturen (Pilzwachstum und Freisetzung von Exoenzymen)
2. Schritt: Maischeherstellung Moromi
Mischung mit Salzlake (17-19% NaCl) führt zur Hemmung der Fäulnis und Geschmacksbildung
3.Schritt: Fermentation
-Zugabe von Starterkultur (Lactobacillus, Pediococcus, Saccharomyces rouxi) Dauer 8-10 mon
-Schimmeplpilzeigene Enzyme:
 Amylasen: Abbau der Weizenstärke zu Glucose
 Proteasen: Abbau des Sojaproteins zu Aminosäuren
-Wachstum der Hefen und Pediokokken wenn genug Glucose vorhanden ist
Hefen: alkoholische Gärung
Pediokokken: Milchsäuregärung
pH-Wert zum Ende bei etwa 4,8, aber hohe Salzgehalt
4. Schritt:
Abtrennen fester Bestandteile (pressen)
Erhitzung der Flüssigkeit auf 80°C (Pasteurisieren)
Abfüllung in Flaschen, evtl. unter Zugabe chemischer Konservierungsstoffe
Endprodukt enthält:
18% NaCl
1,2-1,3% Glutamat
0,7-0,9% Aminostickstoff
1,5-1,6% Gesamtstickstoff
1,9-4,4% reduzierende Zucker
1,5-2,1% Alkohol
 

Sojasauce
Sauerkraut
fermentation: aerobe Mischflora ---> bildet Geschmackskomponenten, senkt redoxpotential
heterofermentative Milchsäurebakterien: produzieren Lactat ---> pH-Wert sinkt
-Aromabildung (Säuren, Ester)
Endprodukt: 0,7-2% Milchsäure, pH-Wert bei etwa 3,5

Spätblähungen bei der Milch---> Käsefehler
-Aufblähen durch Gas ----> unangenehmer Geschmack
-Sporen gelangen über Silage in die Kuh/ die Milch
-Sporen überleben die Pasteurisierung
-Sporen keimen während der Käsereifung aus
-Abbau der Milchsäure zu Buttersäure wirkt sich aus auf den Geschmack und Wasserstoffbildung (Gas)
sehr große Lochbildung durch entstehendes CO₂ ---> der Käse sieht zerrissen aus

Wasser in Fett-Emulsion 82-84% Fett
Süßrahm: ungesäuerter Rahm pH>6,4
Sauerrahm: bakteriell gesäuerter Rahm pH<5,1 und Zugabe von Säureweckern während der Herstellung
 

EU-Richtlinie: 1829/2003/EG
Freisetzungsrichtlinie: 2001/18/EG
Wichtig: 1830/2003/EG

Erzeugung von und mit gentechnisch veränderten Organismen (GVO) nach Gentechnikgesetz.

Nährmedien enthalten in der Regel 95-97% Wasser. Substrate, Stickstoffquellen, Mineralstoffe und Vitamine sind gelöst oder suspendiert im Nährmedium.
Technische Zusätze: Antischaummittel (Speiseöl), Präkursoren (Intermediate des Zielproduktes, zur Erhöhung der Ausbeute). Nährmedium muss an die Ansprüche der Mikroorganismen angepasst werden : Energiequelle, Stickstoffbedarf, Mineralstoffbedarf

Schrittweise Anpassung an unterschiedliche Nährstoffzusammensetzung und Volumenerhöhung.
Upstream-Processing: Herstellung des Fermentationsmediums (Züchtung von Stammkultur, die ausreichend ist, um im Produktionsfermenter genügend Mikroorganismen zu bilden.  Schrittweise Vergrößerung der Kulturstufen im Verhältnis 1:3 bis 1:10
Schritte: Master Cell Bank (-196°C, in flüssigem Stickstoff gelagert)
2. Working Cell Bank (1000 KbE/ml, gefroren in kleinen Portionen)
3. Impfgutvermehrung von Agrarplatte bis Fermenter
Agrarplatte (Kolonie)-Schrägagar(Stammkultur)-300ml Schüttelkultur-3l Rührkultur-30-3.000l Vorfermenter- bis 500.000l Produktionsfermenter
Langsame Schritte zur Volumenerhöhung, weil Mikroorganismen sich je nach Volumenumfang anders verhalten, da die Sauerstoffzufuhr über verschiedene Prinzipien erfolgt, die Homogenität soll stets erhalten bleiben (optimierte Bedingungen für die Eigenschaften der Mikroorganimen). Bei direkter Gabe der Mikroorganismen in den Produktionsfermenter besteht durch die lange Dauer die Gefahr der Vermehrung schädigender Mikroorganismen.

Emers-Verfahren: ursprünglich
Oberflächenverfahren, Kultivierung auf festen/flüssigen Nährböden, wie z.B. Agarplatte, Belüftung der Oberfläche, Extraktion de Produktes nach Abschluss der Fermentation

Submers-Verfahren
Vorkulturführung, die Kultivierung erfolgt in Fermentern, Sauerstoffversorgung erfolgt durch den im Nährmedium gelösten Sauerstoff.

Stellgröße: Parameter, die man direkt einstellen kann (Prozesssteuerung), Heiz-/KühlstromàTemperatur (Mikroorganismen besitzen ein Temperatur-Optimum:thermophil, mesophil, psychrophil), Dosage des Sauerstoffs (gelöster Sauerstoff) à Aerobier, aerotolerant, fakultativ anaerob.
Zustandsgrößen: beschreiben das Medium und den Prozess und sind indirekt durch Stellgrößen beeinflussbar. pH-Wert: Produktion der Biomasse, Wachstumsrate, organische Verbindungen.
Temperatur: Produktion von Biomasse, Wachstumsrate, organische Verbindungen
Zielgrößen: Ergebnis, ist nicht direkt beeinflussbar: Produktion von Biomasse, Wachstumsrate beeinflusst durch den pH-Wert , Substratkonzentration, gelöstem Sauerstoff, Temperatur und gebildeten organischen Verbindungen.
Ziel: Optimiertes Zellwachstum, dafür muss unter anderem die Temperatur entsprechend eingestellt werden.

Stellgrößen. Alle 3 Faktoren haben einen großen Einfluss auf Wachstum, Entwicklung und Produktionder Mikroorganismen. Müssen je nach den Ansprüchen der entsprechenden Mikroorganismen eingestellt werden.

Ziel: vollständige Abtrennung der Zellmasse, Produkteinheit
1. Zellernte: Abtrennung des Nährmediums (disperses System)durch Zentrifugation oder Filtration.
2. Zellaufschluss: Zerstörung der Zellwände/-membranen um intrazellulär gebildete organische Verbindungen/Stoffwechselprodukte gewinnen zu können. Membranen müssen durchlässig gemacht werden, oder durch Scherkräfte zerrissen werden. Mit: Rührwerkskugelmühlen oder Hochdruckhomogenisation.
3.Produktgewinnung und Konzentrierung:  Abtrennung des Produktes von den Zellwänden- Präzipation (Fällung von Proteinen-isoelektrischer Punkt), Schaumseperation, Membranseperation (Ultrafiltration), Solventextraktion.
4. Produktreinigung: Abtrennung unerwünschter Proteineund Enzyme, um Reinheitsanfporderungen zu erfüllen. Elektrokinetische Trennverfahren, Chromatographische Trennverfahren.
5. Trocknung: Senkung des aw-Werts: Haltbarkeit, Stabilität, Lagerfähigkeit. Handhabung: Gefriertrocknung oder Sprühtrocknung.

Sedimentation:  Wirkung der Schwerkraft. Trennung nach Dichte (disperse Phase und kontinuierliche Phase). Absetzen der Teilchen. Ziel: Entmischung von Suspensionen in klare Flüssigkeit und Sediment.
Filtration: Ziel: Abscheidung von Feststoffteilchen aus Suspensionen in Filtrat und Filterkuchen (Retentat). Wirkende Kräfte: Druckdifferenz, Trennung nach Größe, Prozess: Zurückhalten der Teilchen.
Zentrifugation:  Ziel: Entmischen von Suspensionen in Zentrifugat und Sediment. Wirkende Kräfte: Schwerkraft, Fliehkraft. Trennung nach Dichte. Prozess: Absetzen der Teilchen.

Ausfällen der Proteine aus der Suspension, weil Proteine zu Verbunden aggregieren.  Änderung der Eigenschaften des Solvens.
Salz (Aussalzen): Abnahme der Löslichkeit, Herabsetzen der Interaktionsenergien.  Besonders Ammoniumsulfat geeignet.  Organische Lösungsmittel: aw-Wert-Senkung führt zur Senkung der Proteinlöslichkeit (müssen wasserlöslich sein und keine Konformationsänderung der Proteine): Ethanol, Isopropanol, Aceton.
2. Änderung der Eigenschaften der Proteine: Ausfällen am Isoelektrischen Punkt (Nettoladung des Proteins=0, geringste Löslichkeit). Hitzebehandlung und KyropräzipitationàDenaturierung und Ausfall.
3. Affinitätspräzipitation: Affinitätsliganden (Coenzym+Enzym, Antigen+Antikörper). Komplexierung und Fällung: sehr spezifisch.

Trennung von Stoffgemischen, meist molekular – bzw. kolloiddisperse Fluide mithilfe von speziell auf das Trennproblem abgestimmte Membran: Retentant und Permeat.
Membranfiltration: Porengröße 0,1-10mycrometer durch hydrostatischen Druck (0,5-2bar) zur Abtrennung von Zellen (Zellernte).
Ultrafiltration: Porengröße 1-10nm. Durch hydrostatischen Druck: 2-10bar. Zur Abtrennung von Proteinen /Entsalzung.
Die Porengröße unterscheidet sich je nach Anwendungsverfahren und richtet sich auch danach, was abgetrennt werden soll.

Zweck: Trennung von N-Acetyl-D-Methionin und N-Acetyl-L-Methionin zur Gewinnung von L-Methionin.
Aufbau des Reaktors: Hochfasermodul mit immobilisierten Enzym enthält die : Ultrafiltrationsmembran (aus organischen Polymeren) mit geringer Porengröße:enzymatisch umgesetztes Produkt wird durchgelassen, das Enzym nicht. Das Substrat wird durch den Sterilfilter geleitet, damit keine Mikroorganismen in die Anlage gelangen, die dann das Enzym zerstören könnten. Polarimeter dient der Prozesskontrolle: Hier findet eine Messung der Konzentration an optisch aktiven Substanzen statt. Wärmeaustauscher dient der Regulierung der Temperatur.

Produktion induzierbarer Enzyme :  Nährmedien enthalten einen Induktor, um die Codierung der Strukturgene zu induzieren.  (Stärke-Amylase, Cellulose-Cellulase, Saccharose-Saccharase). Eine langsame und stetige Zufuhr des Induktors ist notwendig.
Problem: Feedback-Hemmung durch das Endprodukt: verschiedene Aminosäuren hemmen die Bildung von Proteasen. Zellen und Enzyme werden auf Trägermaterialien fixiert (Buchenholzspäne bei Essigherstellung =klassischer weg, Kieselgel). Enzyme können Reaktionen ohne Anwesenheit des ursprünglichen Organismus durchführen.
Vorteile trägerfixierter Enzyme: Erhöhung der Hitze-und pH-Stabilität, längere Lebensdauer, Mehrfachverwendung der Enzyme möglich, kontinuierliche Prozessführung im Bioreaktor möglich, Vereinfachung der Produktreinigung, Verbesserung der Produktqualität. Immobilisierte Enzyme und Zellen können partikelgebunden oder membrangebunden sein, das führt zu einer möglichen langen Benutzung der Enzyme, die sonst mit dem Produkt wegfließen würden.
Nachteile: Aktivitätsverlust, geringe Diffusionsgeschwindigkeit, fixierte Zellen brauchen eine Erholungsphase nach der Produktion.

Corynebacterium glutamicum ist Biotin-auxotroph. Biotin muss demnach immer von außen zugeführt werden. Durch limitierende Zugabe von Biotin kommt es zu einer Veränderung der Zusammensetzung der Zellmembran, das bewirkt einen verstärkten aktiven Transport von L-Glutamat aus der Zelle. Die Folge: L-Glutamat gelangt in das Medium und wirkt somit nicht weiter hemmend auf seine eigene Synthese.

Citronensäure entsteht natürlicherweise im Stoffwechsel im Citratzyklus. Synthese = Submersverfahren. Vorfermenter: hoher pH-Wert zur Mycelbildung des Asperigillus niger.
Hauptfermenter: eigentliche Citronensäuresynthese findet hier statt, pH-Absenkung auf <3,5 verhindert den Abbau der Citronensäure, verbessert die Durchlässigkeit der Membranen für Citronensäure (Kein Zellaufschluss mehr nötig) und es findet kein Mycelwachstum mehr statt.