Analytische Chemie III: Elektroanalytik und Trennmethoden

Verwendung von einem Tiefpassfilter, der hochfrequ. Rauschen unterdrückt.

• gefüllt mit kleinen Partikel (5 \(\mu m\)) aus Siliziumdioxid / Kieselgel (SiO2) oder Aluminiumoxid (Al2O3)
• apolares Eluent
• apolarster Stoff eluiert zuerst

Nachteil: Man kann keine wässrige Lösungen untersuchen, da die Säulenaktivität durch Wasser reduziert wird.

Beschichtung von Kieselgelpartikel durch Reaktion mit Alkylchlorsilanen.

Bei der Silanisierung reagieren nicht alle freien Silanolgruppen. Der Prozess der Silanisierung der verbleidenden Silanolgruppen mit Trimethylchorsilan nennt man End-Capping.

• kompatibel für Detektionsmethode (z.B. nicht absorbieren im Bereich der Detektion)
• nicht zu viskos
• entgast, da O2 absorbiert
• pH gepuffert
• nützliche Polarität (für gute Trennleistung)

• Je länger der apolare Rest desto höher die Trennleistung und die Retentionszeit.
• Damit die stat. Phase nicht hydrolysiert bei tiefem pH, können die Silanolgruppen auch doppelt verbrückt werden
• kleine Porengrösse --> grössere Zurückhaltung
• End-Capping
• funktionalisierung der stat. Phase (z.B. mit chiralen Gruppen, um Enantiomere zu trennen)
   

Man versieht die stat. Phase mit polaren funktionellen Gruppen, wie z.B. Amino oder Cyano
 

• Verwendung kleiner Partikel (A-Faktor wird minimiert und Massenübergang C wird unabhängig von der Fliessgeschw.) --> benötigt hohe Drücke
• längere Säule

Polarität des Lösungsmittel wird während der Aufnahme graduell geändert. Damit wird die Analyse schneller, da mehrere Analytpolaritäten erfasst werden können.

• UV-Vis-Absorption
  • Standarddetektor
  • Substanzen müssen ein absorb. Strukturelement aufweisen
• Brechungsindexdetektor (RI-Detektor)
  • Vorteil: Universell
  • Nachteil: wenig empfindlich
  • Einsatzgebiet: Alkohole, Kohlenhydrate
• Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)
  • Vorteil: Universell
  • Nachteil: wenig empfindlich, heikel in der Anwendung
• Fluoreszenzdetektor
  • Vorteil: sehr empfindlich
  • Nachteil: nur für fluoreszierende Substanzen
• Massenspektroskopie
  • Vorteil: Informationen über Struktur der Substanzen, automatisierte Erkennung durch Datenbanken
  • Nachteil: teuer
  • Einsatzgebiet: Analyse von komplexen Proben mit unbekannter Zusammensetzung
• Coulometrische und Amperometrischer Detektor
  • Vorteil: sehr empfindlich
  • Nachteil: nur redoxaktive Substanzen
  • Einsatzgebiet: Amine, Nitroverbindungen, Aldehyde, Ketone, Neurotransmitter
• Derivatisierung
  • Vorteil: Analyte können der UV-Vis Detekttion zugänglich gemacht werden, Empfindlichkeit der Fluoreszenzdetektion kann genützt werden
  • Nachteil: manchmal langsame Derivatisierungsreaktionen
  • Einsatzgebiet: Aminosäuren und sonstige Biomoleküle

Brechung < ELSD < UV-Vis < Amperometrisch < Fluoreszenz

• Spektrometer mit einstellbarer Wellenlänge
• Photometer mit festeingestellter Wellenlänge
• DAD (Diodenarray Detektor)

DAD = Diodenarrayspektrometer

1. Die Wellenlänge kann optimiert werden, da während der Elution das ganze Spectrum abgefahren wird.
2. Zusätzliche Information über Peakreinheit und Identität.

Nachteil: geringere Empfindlichkeit

• niedrige Viskosität --> kleinerer Druck benötigt
• niedriger Cut-off (unter 190 nm)

• UV-Vis-Absorption
  • Standarddetektor
  • Substanzen müssen ein absorb. Strukturelement aufweisen
• Brechungsindexdetektor (RI-Detektor)
  • Vorteil: Universell
  • Nachteil: wenig empfindlich
  • Einsatzgebiet: Alkohole, Kohlenhydrate
• Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)
  • Vorteil: Universell
  • Nachteil: wenig empfindlich, heikel in der Anwendung
• Fluoreszenzdetektor
  • Vorteil: sehr empfindlich
  • Nachteil: nur für fluoreszierende Substanzen
• Massenspektroskopie
  • Vorteil: Informationen über Struktur der Substanzen, automatisierte Erkennung durch Datenbanken
  • Nachteil: teuer
  • Einsatzgebiet: Analyse von komplexen Proben mit unbekannter Zusammensetzung
• Coulometrische und Amperometrischer Detektor
  • Vorteil: sehr empfindlich
  • Nachteil: nur redoxaktive Substanzen
  • Einsatzgebiet: Amine, Nitroverbindungen, Aldehyde, Ketone, Neurotransmitter
• Derivatisierung
  • Vorteil: Analyte können der UV-Vis Detekttion zugänglich gemacht werden, Empfindlichkeit der Fluoreszenzdetektion kann genützt werden
  • Nachteil: manchmal langsame Derivatisierungsreaktionen
  • Einsatzgebiet: Aminosäuren und sonstige Biomoleküle

• APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)
• ESI (Electronspray Ionisation)

Vorteile:

• Billig
• einfach
• schnell
• parallele Analyse möglich
• 2D Analyse

Nachteil:

• nur 1 mal verwendbar

Vorteil:

• hohe Selektivität
• niedrige Hintergrundsignale

Nachteil:

• nicht universell einsetzbar

Selektivität biochemischer Reaktionen wird für die Analytik ausgenützt.

Vorteil: Vielseitig (Umweltanalytik bis Nachweis von Viren), schnell und billig

Nachteil: Aufwendige Entwicklung

Enzyme-Assays, Immuno-Assays

Vorteile:

• Selektiv für Naturstoffe in komplexen Proben
• Enantioselektiv
• Selektivität, d.h. nur geringe Probenaufbereitung nötig

Nachteil:

• man ist auf Enzyme angewiesen und daher eingeschränkt bei der Analyse

Nachweis von NAD+/NADH mittels UV-Absorption oder Nachweis von farbigem Produkt, welches in einer Nebenreaktion aus H2O2 entsteht.

• NAD mit Fluorophoren umsetzen und Fluoreszenzdetektion durchführen
• Amperometrische Detektion
• Radiometrische Detektion

• Ethanolbestimmung mit Alkoholdehydrogenase
• Glucosebestimmung mit Hexokinase
• Lactatbestimmung mit Lactatdehydrogenase

Analyte (Antigene) werden durch Antikörper, welche auf einer Oberfläche gebunden sind, erkannt. Man verwendet entweder ein Gemisch von Antikörpern (polyklonal) oder ein monoklonaler Antikörper, welcher in einem Tier produziert wurde, indem dieses mit einem Antigen infiziert wurde und dessen Körper dann Antigenen produziert.

• Kompetitive Immuno-Assays: Gemisch von markierten Analytderivaten und normalen Antigenen mittels resultierender Absorption (je schwächer desto mehr normale Antige gebunden)
• nicht-kompetitive Immuno-Assays: Gebundene Antigene werden in einem zweiten Schritt mit einem markierten Antikörper versehen (Bildung eines Sandwichkomplex)
• Radio-Immuno-Assay (RIA)
• Fluoreszenz-Immuno-Assay
• ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay): Schwangeschaftstest

Ist ein Immuno-Assay.

Antigen (von der Schwangerschaft) bindet an mobile markierte Antikörper. Der Antigen-Antikörper-Komplex bindet dann an einem fixierten Antikörper und der fixierte Sandwichkomplex hat dann eine gewisse Farbe.

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

Antigen (HIV-Virus) bindet an Antikörper. Sekundäre enzymmarkierte Antikörper binden an den Antige-Antikörper-Komplex. Farbloses Substrat wird zugefügt und umgesetzt durch die enzymmarkierten Antikörper.

Amplifikation:

1. DNA Denaturierung
2. Primer Annealling
3. Primer Extension durch Polymerase

Die Untersuchung der ganzen DNA Sequenz ist zu aufwändig --> Analyse von enzymatisch erhaltenen DNA-Fragmenten

Vaterschaftstest, Nachweis vererbbarer Krankheiten, Forensik

1. Es gibt viel mehr Proteine
2. Keine Möglichkeit der Amplifikation wie bei der DNA-Analyse

Trennung mittels planaren 2D-Gelektrophorese

1. Isoelektrische Fokussierung in einem pH-Gradienten (Proteine wandern zum Isoelektrischen Punkt, wo keine Nettoladung vorhanden)
2. SDS-PAGE (Gelektrophorese): Trnnung nach Grösse --> Bestimmung der Molekularmasse

• Detektion mittels Antikörper
• Fingerprinting (Spaltung mit Serinproteasen und Überlappungsanalyse)
• ICP-MS

Trennung der Probe aufgrund der Grösse. Säulen bestehen aus Gelen mit kontrollierter Porengrösse. Kleine Moleküle werden zurückgehalten, da sie in die Poren gelangen.

Detektion mittels Brechungsindex.

Anwendung: Trennung von Proteinen oder Polymeren.

Ionenaustauschchromatographie.

Säulen werden mit einem Ionenaustauschharz gepackt (sulfonate für Kationen, quartäre Amine für Anionen). Die Analytionen werden durch die elektrostat. WW festgehalten. Je kleiner und je grösser die Ladung desto stärker die Bindung und desto später die Eluierung. Die Elution erfolgt durch einen Ionenaustausch mit einem Eluention.

Anwendung: Vor allem für anorg. Ionen, aber auch möglich für org. Ionen. Vor allem für Analyse von Phosphaten und Sulfaten genutzt.

Sehr tiefe Nachweisgrenze bis 100 ppb

Leitfähigkeitsmessung (anorganische Moleküle), UV-Vis und Coulometrie für organ. Moleküle.

Bei der Leitfähigkeitsmessung misst man die Differenz zwischen der spez. Leitfähigkeit des Eluent und des Analyt (da der Eluent ein Hintergrundsignal prod). Die verringert die Nachweisgrenze --> Einsatz von chem. Suppressor, d.h. man führt einen Ionenaustausch am Säulenausgang durch, wodurch der Puffer neutralisiert wird.