Molekularbiologie

in Abwesenheit von Tetracycline erfolgt die Transkription! --> wenn Tetracycline nicht vorhanden!

also Zugabe von Tetracyclin verhindert also die Genexpression!

Genexpression wird inhibiert, tTA bindet nicht an RNA Polymerase.

aus 7 Tet-Operatpr 2-Sequenzen

FGFR1 = Fibroblast growth factor receptor like protein (Tumorsuppressor)

(interagiert mit der extrazellulären Matrix,die an anderen Zellen gebunden ist, um die Zelladhäsion zu fördern)

CAP BS- Promotor-Operator-lacZ-lacY-lacA-Terminator

lacZ= beta-Galactosidase spaltet Lactose in Glucose und Galactose

lacY= Galactosid-Permease: Transporterprotein für Lactose in das Zellinnere

lacA= glactosidase acetyltransferase

lac1 ist unabhängig und nicht reguliert. lac1 ist in unmittelbarer Nähe von lac Operon. Der bildet/codiert den Supressor!

Supressor: P-lac1-T (siehe bild)

Allolactose --> Übergangsprodukt, das die beta Galaktose binden kann.

Regulation durch Repressor. lac Operator bindet an Repressor und es findet keine Transkription statt.

wenn Repressor an Operator bindet keine Transkription! Jedoch bindet Repressor nicht an Operator wenn der Induktor (Allolactose/IPTG) gebunden wird.

Isoprppyl Thiogalactoside (IPTG)

als Tetramer

• Repressor darf nicht gebunden sein
• Induktor (cAMP) bindet an CAP (catabolite activator protein) BS, (CAP muss vorhanden sein) 
• RNA Polymerase wird somit aktiviert
• Transkription

- Glucose ist für die Zelle einfach zu verwerten und spart Energie.

Glukose kommt in die Zelle durch ptGS rein,

IIA wird phosphoryliert zu IIA-P und das P wird auf Glukose übertragen. Wenn jedoch das phosphorilierte IIA-P nicht auf die Glukose übertragen werden kann, hemmt sie die Lactose Permease und die Lactose kommt nicht mal in die Zelle rein. Permease wird durch IIA blockiert.

(IIA^glc-P ist ein Glucose-spezifische Phosphotransferase Protein.)

Wenn Glucose nicht mehr vorhanden:

IIA^glc-P kann das P nicht mehr auf Glukose übertragen und IIA-P blockiert die Lactose Permease nicht mehr.

IIA^glc-P aktiviert die Adenylcyclase, ATP wird zu cAMP--> Induktor! CAP bindet cAMP!

Fazit: 

• IIA^glc-P --> blockiert die Lactose Permease nicht, cAMP(Induktor) wird aktiviert
• IIA^{glc    --> blockiert die Lactose Permease, da P an Glukose gegeben wurde.}

Repressor hat gebunden, sitzt am Operator

Allolactose bindet am Repressor.

• Repressor an Operator gebunden
• lactose-permease durch IIA gehemmt
• Adenylcyclase nicht aktiviert
• wenn glucose aufgebraucht ist
• IIAP wieder vorhanden, da P nicht an Glukose abgegeben werden kann
• Lacotse Permease wird nicht mehr blockiert
• Adenylcyclase wird aktiviert, cAMP wird produziert, das an CAP bindet, CAP and CAP BS, RNA Polymerase wird aktiviert und die Transkription fängt an mit lacZ,lacY,lacA..

Hitzestabile DNA-polymerase. --> DNA Replikation

Thermus aquaticus

künstich hergestellt: Pyrococcus-ähnlichen Polymerase mit einer Domäne, die die Prozessaktivität erhöht, proof reading.

Denaturiern (94-95°C)

Annealing (50-56°C)

Extending stage (72°C)

5'-3'

forward--> unteren Strang

reverse--> oberen Strang

35x --> 2³⁵ Kopien werden erstellt.

X_n=X₀x(1+E)ⁿ

^{E ist abhängig von den PCR Primern.}

A,T 2°C

GC 4°C

Man passt die Primerlänge an, bis sie etwa 4°C Unterschied haben.

mRNA wird durch reverse Transkriptase zu dscDNA

Unterschied: template bei reverse Transkri. --> mRNA

• keine 100% Reinigung
• man hat immernoch gewissen AS an N'Terminus, die eventuell stören (Sequenzen vom Vektor)

• GGATCC
• CCTAGG

• GAATTC
• GTTAAG

1. Protein auf die Säule geben. Säule hat Ni²⁺ -> Ladung!
2. Die Proteine binden an der Säule
3. mit Imidazol eluieren, Lipase kommt durch
4. Imidazol durch Dialyse entfernen