Tiergenetik

Gen an: Wenn die CpG Insel nicht methyliert ist, können die Transkriptionsfaktoren an die Insel binden

Gen aus: Wenn die CpG Insel methyliert ist, können die Transkriptionsfaktoren nicht an die Insel binden

Methylierung verhindert eine Bindung und kann dadurch sowohl negative als auch positive Genregulation vermitteln. Dabei ist negative Genregulation, dass weniger Protein hergestellt wird aus dem entsprechenden Gen. Positive Genregulation bedeutet hingegen, dass die Genexpression erhöht wird.

Methylierung Enhancer: Verhindert Bindung des Enhancers => keine positive Genregulation => negative Genregulation = weniger Transkription

Methylierung Silencer: Verhindert Bindung des Silencers => keine negative Genregulation => positive Genregulation = mehr Transkription

1. Konstitutive Promotoren sind Promotoren, welche in allen Zellen vorkommen weil sie in Genen vorkommen, die in allen Zellen essentiell sind

2. Gewebe-Spezifische Promotoren sind Promotoren, die in Genen vorkommen, welche Gewebe/Zelltyp spezifische Gene exprimieren => Genexpression nur in einem Gewebe beeinflusst

3. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die durch endogene/exogene Faktoren aus und einschaltbar sind. Sie sind unterteilbar in:

3.1 Chemisch induzierbare Promotoren: Diese Promotoren werden durch Moleküle aktiviert/deaktiviert

3.2 Physikalisch induzierbare Promotoren: Diese Promotoren werden durch Licht oder Temperatur aktiviert/deaktiviert

4. Synthetische Promotoren sind Promotoren die künstlich hergestellt wurden.

Die Promotor Aktivität kann durch Luciferase Assay nachgewiesen werden. Dabei wird nach dem entsprechenden Promotor das Luciferase Reportergen eingebaut. Je stärker aktiv der Promotor ist, desto mehr wird Luciferase exprimiert. Da Luciferase durch die enzymatische Umsetzung Bioluminszenz erzeugt, ist die Menge an emittierten Lichts bestimmter Wellenlänge direkt proportional zur Genexpression/Promotoraktivität.

Es können auch andere Reportergene genutzt werden wie z.B GFP (Fluoreszenz), ß- Galactosidase (Blau-Weiß Selektion)

Neben der kanonischen (= „so wie gedacht“, „Normal“) linearen mRNA, kann durch Backsplicing, zirkuläre mRNA entstehen. 

Backsplicing: Das Ende eines Exons wird mit Anfang eines Exons verknüpft. Dadurch entsteht eine zirkuläre mRNA.

Diese ist noch nicht gut erforscht, es wird aber vermutet, dass Backsplicing in Zusammenhang mit Tumorgenese stehen kann, da zirkuläre mRNA nicht übersetzt wird, aber den Metabolismus der Zelle beeinflussen kann. 

Der Nonsense-Mediated mRNA decay ist ein wichtiger Kontrollmechanismus. Die Zelle erkennt, wenn verkürzte Nonsense Proteine entstehen. Das sind Proteine, die nicht funktionell sind, weil ein Stoppcodon in die Sequenz mutiert ist. Dadurch hört die Synthese der AS-Sequenz verfrüht auf und ein verkürztes Protein entsteht.

Diese verkürzten Proteine sind häufig nicht nur nicht-funktional, sondern sogar schädlich für die Zelle. Aus diesem Grund hat sich evolutionär ein Gegenmechanismus entwickelt.

• Gene Disruption/inaktivierung: Protein kodierende Gen muss man inaktivieren => Kodak Sequenz inaktivieren, Mutation im Promotor hervorrufen oder kodierende Abschnitt von Gen entfernen

• Gene Modification: innerhalb kodierende Genbereich => Mutation im Exonbereich => gezielte AS-Austausch oder Basenaustausch, um Funktion/Struktur anzupassen => Replacement in AS in Proteinsequenz (Genfunktion wird auch entsprechend modifiziert)

z.B. Darmkrebs => frühzeitige Stoppcodon => keine kontrollierbare Proliferation

• Gene Replacement: Ersetzen von strukturellen Elementen oder reg. Elementen, kann man auch zwischen Spezies machen (Maus IGgamma mit Mensch IGgamma ersetzen) oder innerhalb von Spezies machen => Gen vor Promotor ausschneiden und ersetzen oder Gen mit Protomor ausschneiden und ersetzten, wenn Promotor auch angepasst werden musst 

• Modulation of Gene activity: Veränderung des Expression eines Gens => Regulatorische elemente angreifen/mutieren => Enhancer, Sielender, Promoter, 3’ oder 5’UTR modifizieren => z.B. Gen Knockout mit siRNA 

Gene können entweder gezielt an einen ganz bestimmten Ort (Locus) eingebracht werden = gene targeting. Gene-Targeting wird durch CRISPR/CAS9, Meganukleasen, TALENs und Zink-Finger Nukleasen und nachfolgendem HDR erreicht.

Oder man kann Gene an zufälligen Orten insertieren = Genaddition 

In der Biotechnologie wird eine modifizierte DNA-Polymerase 1 verwendet. Dabei wird die 5‘-3‘ Exonuklease Domäne durch die Protease Subtilisin abgespalten. Das entstehende Polymerase-Fragment nennt man Klenow Fragment.

Das Klenow Fragment (Links) besitzt damit noch die 3‘-5‘ Exonuklease Aktivität und die 5‘-3‘ Polymerase Aktivität. Es ist also in der Lage von 5‘ nach 3‘ den komplementären Strang zu bilden und zusätzlich, dazu 3‘ Überhänge (heißt das ein DNA Einzelstrang mit 3‘ Ende vorhanden ist) zu entfernen. 

Dieses Klenow Fragment wird dazu genutzt 3‘ Overhangs abzubauen, ohne die 5‘-3‘ DNA zu entfernen (5‘-3‘ Exonuklease Domäne entfernt) => Entstehung Blunt End

ORI: Origin of Replication, Hier wird die Replikation des Plasmids eingeleitet

MCS: Multiple Cloning Site, enthält Schnittstellen für Restriktionsenzyme

AB-Resistenz: Resistenz gegen Antibiotika

Blau-Weiß-Selektion:

= Methode zur Überprüfung, ob Zielgen in das Plasmid kloniert worden ist.

In der MCS (Multiple cloning site) befindet sich das Gen LacZ, welches für ß- Galactosidase codiert. In E.coli verdaut sie Lactose zur Glucose und Galactose. Das Enzym ist jedoch auch in der Lage Xgal in einen blauen Farbstoff und Galactose zu spalten.

Wenn jedoch ein Gen in die MCS kloniert worden ist, ist das LacZ Gen unterbrochen. Das führt zur Entstehung eines nicht- funktionalen ß-Galactosidase Proteins.

Wenn nun das Lac-Operon aktiviert (durch einen Induktor wie Lactose, IPTG) wird, entsteht bei intaktem Gen funktionale ß-Galactosidase, die Xgal zu dem blauen Farbstoff spalten. Der blaue Farbstoff bedeutet, dass die Zellen in ihrem Plasmid kein insertiertes Gen besitzen.

Wenn hingegen ein Gen insertiert ist, entsteht keine funktionale ß-Galactosidase. Die entsprechenden Zellen erscheinen weiß.

Herkömmliche qPCR Methoden sind nicht nutzbar, wenn man kleine DNA-Mengen in einem großen DNA-Sample nachweisen will. In diesem Fall würde das restliche DNA- Sample (z.B Wild-Typ) ein viel größeres Fluoreszenzsignal erzeugen, als das ganz wenig vorhandene Ziel-DNA Molekül (z.B Mutation). Das führt dazu, dass dieses Floureszenzsignal untergeht.

Lösung: Digital Droplet PCR

Die Methode trennt dazu die gesamte Probe in kleinere Teile auf. Dies wird genauer gesagt dadurch erreicht, dass man kleinere Tröpfchen (Droplets) erzeugt.

Ungefähr 20000 Tropfen, in manchen ist nur die Ziel-DNA, in manchen gar keine und in manchen Ziel-DNA und andere DNA.

Mit jedem Tropfen wird die PCR durchgeführt und die Target DNA mit einem spezifischen Fluoreszenzfarbstoff markiert.

Anhand der Fluoreszenzsignale kann die DNA-Konzentration des Targets in der Gesamtprobe abgeschätzt werden

d.h Digital Droplet PCR ist eine quantitative Analyse Methode, um ein DNA-Molekül in einer Probe zu quantifizieren, in der es gering konzentriert ist

DNA Ebene: Southern-Blot:= spezifischer Nachweis von bestimmten DNA-Sequenzen

1.) DNA-Verdau zu DNA-Fragmenten (Restriktionsenzyme)

2.) Auftrennung der Fragmente nach Größe (Gelelektrophorese)

3.) Übertragung der DNA auf einen festen Filter durch „reine“ Kapillarkraft, Vakuum (Druck) oder elektrische Spannung, weil Gel sehr brüchig ist und leicht kaputt gehen kann (Blotting)

4.) Spezifische DNA die man nachweisen will wird „radioaktiv markiert“ zugegben

5.) DNA hybridisiert mit den komplementären Banden auf dem Filter

6.) Detektion der hybridiserten DNA durch Radioaktivität (z.B 32P)

Protein Ebene: Western-Blot:

1. SDS-PAGE

Proteine sind unterschiedlich geladen & gefaltet => keine gute Auftrennung. Deshalb nutzt man SDS-PAGE und ß- Mercaptoethanol (=> SS-Brücken auflösen), um die Proteine zu denaturieren. SDS ist am Kopf negativ geladen, sodass das Protein der Molekularmasse direkt proportionale negative Ladung trägt.

Die Auftrennung ist nun praktisch nur noch von der Größe abhängig: Kleine Proteine wandern schnell.

2. Übertragung der Proteine auf feste Membran (Blotting) z.B durch elektrische Spannung. Proteine wandern in Richtung Anode, weil negativ geladen.

3. Die Proteine binden über intermolekulare Wechselwirkungen an die Membran.

Da Antikörper unspezifisch an die freien Membranbindestellen binden könnten, müssen diese freien Positionen, vor der Antikörper Detektion geblockt werden, z.B mit BSA

4. Anschließend gibt man einen spezifischen Antikörper hinzu, dessen Paratop spezifisch an das Eptiop des Targetproteins bindet. An diesen Primärantikörper bindet ein zweiter Sekundärantikörper mit Reporterenzym.

Anwendung: Nachweis von speziellen Transgenen

Eine andere Methode zur Nachweis von Transgenen (DNA-Ebene: Digital Droplet PCR

Transgenesis = Übertragung eines Gens von einem artfremden Individuum auf ein anderes Individuum anderer Spezies

Dazu gibt es 3 Schritte:

1. Identifikation = Identifikation des Zielgens, das gewünschte Eigenschaft bewirkt

2. Klonierung = Gen wird in Vektor kloniert

3. Transfektion = pronuklearer (vor dem Fusion Sperm & Eizelle) Transfer bewirkt künstliche Zygote (in vitro Fertilisation)

1. Befruchtung

2. Isolation der Zygote

3. Im Pronukleusstatus Gen transfezieren

Nachteile: keine Kontrolle über den Integrationsort, Kontrolle der transgenen Transaktion passiert erst nach Geburt, nur Genaddition (keine Genmodifikation, Gensubstitution oder Gendeletion möglich)

4. Zufällige Integration (oder Gene Targeting)

Methoden:

• DNA Mikroinjektion: nur 1-5% transgene Tiere

Limitations: damaging to embryos, not all embryos survive, very low efficiency, no control of gene insertion

• Transposon-Transfektion: Transposition über cut and paste Mechanismus von DNA-Transposons => Limitation in Gengröße, die man hinzufügen kann
• Virale Transduktion: Limitation in Gengröße & Sicherheitsbedenken

Dabei nutzt man pluripotente Stammzellen aus, die zu beliebigen Geweben differenzieren können (außer Plazenta). Dabei wurden diesen Stammzellen (NTSC, ES, iPS usw.) künstliche Gene eingefügt. Das bedeutet wenn sich diese Stammzellen zu neuen Zellen differenzieren, dass diese Zellen ebenfalls das Zielgen (Gene of Interest) enthalten.

Die zelluläre Pluripotenz kann auf verschiedene Weisen erhalten werden. Man kann Embryonale Stammzellen aus der Blastocyste gewinnen oder aus bereits differenzierten Zellen die Pluripotenz regenerieren, durch Aktivierung spezifischer Pluripotenzmarker.

• 100% transgenic animals
• homologous recombination + gene targeting => exactly in the position in the genome we want 

Eine andere Möglichkeit für Cell mediated Transgenesis  ist die Herstellung transgener Nuclear-Transfer-Stem-Cells. Das Prinzip hinter NTSC ist, dass bei Oocyten, der Zellkern entfernt wird und ersetzt wird durch einen somatischen Zellkern. Dieser Zellkern aus einer differenzierten Körperzelle, enthält in ihrem Genom das Transgen. Da aus dieser durch Nucleus-Transfer entstandenen künstlichen Oocyte eine Zygote entsteht, besitzt jede Zelle des entstehenden Organismus, das entsprechende Transgen.

Vorgehen:

• isolate somatic cells (for example mammalian glands)

• culture them in vitro => genetic modification in vitro in the cells 

• isolate the DNA from the cells and check, if they carry the gene of interest and if in the exact position we want 

• check if the transgene is expressed 

• collect/isolate oocytes from animals

• remove the genetic material from the oocytes

• activation of oocytes (electrofusion: treated with electric pulls => simulation of the fertilization process => develops and forms the blastomeres usw.) => embryo culture

In der pronuklearen Transfektion, kann das Ergebnis der Transfektion erst nach der Geburt der Tiere überprüft werden und nicht alle Zellen des Organismus müssen zwangsweise das Transgen beinhalten. Das liegt daran, dass die Integration in das Genom zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Meiose passieren kann (Entweder alle Gameten Transgen oder nur 50% usw.). Das bedeutet, dass im Falle der pronuklearen Transfektion unnötig Versuchstiere verschwendet werden.

Bei pronuklearen Transfer mit Mikroinjektion ist einerseits das Problem, dass die Effizienz nur 1-5% beträgt. Darüber Hinaus ist anzumerken, dass der Integrationsort zufällig ist, der Transfektionserfolg erst nach der Geburt kontrolliert werden kann und nur Genaddition möglich ist. Auch entstehen Organismen, bei denen nicht alle Zellen das entsprechende Transgen enthalten.

Eine alternative Methode ist mit NTSC Zell-Basierten Transgenese Methoden zu nennen. Hierbei können auch modernere Gene-Editing Verfahren eingesetzt werden z.B CRISPR/CAS9, um über DSB und HDR ein Gene of Interest einzubringen.

Transgenesemethoden (Gen einbringen):

1. Pronukleare Transfektion

2. NTSC => Cell Mediated Transgenesis

Gene-Editing Methoden (Gen einfügen):

1. Meganuklease

2. TALENs

3. Zink-Finger Nukleasen

4. CRISPR/CAS9

Genadditions-Methode (Gen einfügen):

1. Mikroinjektion

2. Transposon-Transfektion

3. Virale Transduktion

=> Zufälliger Integrationsort

= Genome-Editing („Gene-Editing)

=> Gezieltes Verändern von DNA mithilfe von z.B CRISPR/CAS9, Meganukleasen, TALENs und Zink-Finger Nukleasen

Ziele der Genommodifizierung:

• gezieltes Verändern der DNA von Mikroorganismen (weiße Gentechnik) und Pflanzen (grüne Gentechnik) z.B um mehr Ertrag zu erzielen oder Resistenz gegen Krankheitserreger zu erzeugen, Gentherapie, Korrektur von Punktmutationen, Gen- Knockout

Molecular scissors:

= precise modification within the gene without the incorporation of transgenes

• based on DNA breaks (single strand break or double strand break)
• different repairing mechanisms are available in the cell for the DNA breaks

Repairing mechanisms:

Durch α-, β-, γ-Strahlung kann die DNA beschädigt werden. Aber auch durch Toxine entstehen Doppelstrangbrüche. Diese müssen repariert werden. Dabei ist es wichtig zu verhindern das keine Geninformation verloren geht, da bei entstehenden Gene-Knockouts schwerwiegende Fehler im Organismus auftreten können.

• Non-homologous end-joining: ligation of two ends of DNA, very rapid, not very precise, during this mutations can happen quite often between these two DNA fragments (completely random) => insertion or deletion of nucleotides (can cause a change in the coding frame => gene knockout) => it's very error-prone

Prinzip: Ligation der DNA-Stränge ohne die verlorengegangene DNA zu ersetzen. Das ist nötig wenn kein Template vorhanden ist

Zeitpunkt: G1-Phase (kein homologes Template ist vorhanden)

Anwendung: Gene-Knockout, insertions/deletions & gene disruption

• Homologous directed recombination (HDR): other alleles (undamaged) can serve as a template to repair the break, very precise => allow to change single base pair or insert the desired genetic material through the template DNA, that we would generate

Prinzip: Um die verlorengegangene DNA zu ersetzen, wird entweder das Schwesterchromatid oder das homologe Chromosom als Template genutzt.

Zeitpunkt: S und G2-Phase

Anwendung: Einfügen von gezielten Mutationen, targeted gene addition & precision gene editing

Prinzip:

• Bacteria copy the fragments of bacteriophages and insert them into their genome (located in the CRISPR locus), which are separated always by the same sequence (repeats) => immune memory.

• In front of the CRISPR locus, there is a Cas gene (best known: Cas9; the function of other Cas genes are not known)

• Bacteria have already been informed about the bacteriophage through this CRISPR locus, which tries to invade the bacteria, the whole CRISPR locus will be translated in the pre-crRNA => every repeats generate a hairpin + information about a specific bacteriophage => this will be cleaved in to guide RNAs

• Guide RNAs search bacteriophages and will find complementary bacteriophage DNAs to the guide RNAs

• Cas9 produces an enzyme, which is able to cut the DNA of bacteriophages and generate DBS; bacteriophages don't have a repairing mechanism => the virus is killed! 

• But if the complex is used for cells => the CRISPR-Cas complex binds to the DNA and makes a double-strand break (DBS) => DBS will be repaired through HDR (precise) or Non-Homologous End-Joining (80-90% of the time => random mutation => gene knockout)

• Incorporating the template in vitro, which has the mutation we want to add to the gene of interest => this would be used to repair the DBS! 

• Screen the cells to find if they used HDR (Efficiency around 20%, sometimes higher). But the efficiency of microinjection is 1-3%, so 20% is a really good rate! 

• Genes, that have open chromatin (expressed more, more accessible => the efficiency is higher)

Vorteile:

• Cheap, flexible, simple to design and generate

• schneidet spezifisch an gewünschter Stelle

• höhere Geneditierungseffizienz als ZFNs und TALENs

Anwendung:

• Gene knockout in embryos => efficiency is higher 
• Heilung von Krankheiten, z.B. Sichelzellanämie
• in iPS => krankheitserzeugende Mutationen entfernen, um Krankheit/Defekt in Stammzellen zu heilen
• Gene-Editing bei HIV Zielstrukturen für HIV Resistenz

• To understand what has been written (GWAS, Gene variants, Geneknockouts to understand the function of the gene)
• To cure diseases (Organoids, Gentherapie, Xenotransplantation)
• To feed the growing world population
• To live forever
• To revive extinct animals

• Meganukleasen: Über eine Protein-Domäne (Bindungsdomäne, spezifisch für jeweilige Sequenz) der Meganuklease wird spezifisch an eine Erkennungssequenz gebunden und über die Nuklease-Domäne wird diesen Sequenz geschnitten => an dieser Stelle kann das Gene of Interest integriert werden. 

Da es sehr schwer ist Meganukleasen zu „engineeren“, war die Idee unspezifisch schneidende Endonuklease Domänen (FokI = „fok one“) mit spezifisch DNA-Bindenden Domänen rekombinant zu verbinden. Auf diese Weise erhält man durch Protein Engineering spezifisch bindende Nukleasen, die eine bestimmte Stelle im Genom zerschneiden. Das ist ermöglicht zielgenaue Integration von Gene of Interest. Das Protein Engineering ist dabei, bei Zink Finger Nukleasen einfacher als bei Meganukleasen und noch einfacher bei TAL Effektor Nukleasen (weniger Aminosäuren sind verantwortlich für die spezifische DNA-Bindung)!

• Zinkfinger-Nukleasen: Zink-Finger-Domänen (DNA Erkennungsmotiv) sind rekombinant an Endonuklease (FokI) „engineered“ => jede beliebige DNA-Sequenz kann gebunden und geschnitten werden. 
• Transcription-Activator-Linke (TAL): TAL-Domänen sind rekombinant an Endonuklease (FokI) „engineered“ => jede beliebige DNA-Sequenz kann gebunden und geschnitten werden (in TAL nur 2 Aminosäuren für das spezifische Binden an ein Nukleotid zuständig).
• CRISPR-Cas9

Mikroinjektion = die Injektion von DNA in die Kerne von Einzelzellen, mit Hilfe extrem feiner Glaskapillaren.

Ablauf:

Bei der Mikroinjektion wird DNA über eine eingeführte Kanüle direkt in die Zelle oder sogar den Zellkern gespritzt. Der Vorgang wird unter dem Mikroskop beobachtet und gesteuert. Anschließend integriert sich die DNA - vermutlich im Rahmen von zelleigenen DNA-Reparaturprozessen - ins Genom.

Nachteile:

• DNA Mikroinjektion: nur <1 –5 % Transgene Tiere
• Transposons: Größenlimitierung
• Virale Vektoren: Sicherheitsaspekte, Größenlimitierung
• Keine Kontrolle darüber, wo das Transgen integriert wird
• Transgene Analyse erst nach der Geburt möglich
• Keine Kontrolle über das Geschlecht
• Nur Hinzufügung von Genen möglich => keine Gendeletion, Modifikation, Substitution

• Schutz vor Krankheiten mittels Genomeditierung
• Besamung von vielen Eizellen und somit weiblichen Tieren gleichzeitig
• Erhöhung von Ausbeuten an Produktionsprodukte mittels Genomeditierung, Genmodification

• Anatomische Barrieren: Haut, Atmungsepithel, Darm
• Komplement/ Antimikrobielle Proteine: C3, Defensine
• Innate Immunzellen: Makrophagen, Granulocyten, NK Zellen

Autosomal-dominanter Erbgang:

• Ein Allel bzw. eine Mutation übt bei heterozygotem Vorliegen eine erkennbare Wirkung auf den Phänotyp aus.
• Beide Geschlechter werden gleich wahrscheinlich betroffen.
• Dominante Merkmale überspringen meistens keine Generationen.
• Beide Geschlechter sind gleich wahrscheinlich betroffen.
• Betroffene Individuen haben betroffene Eltern. 

Autosomal-rezessiver Erbgang:

• Die Wirkung eines Allels bzw. einer Mutation ist im heterozygoten Zustand phänotypisch nicht/ kaum erkennbar, jedoch bei homozygotem Vorliegen kommt es zur phänotypischen Manifestation (Erkrankung). 
• Rezessive Merkmale überspringen meistens Generationen.

X-chromosomal rezessiver Erbgang:

• Da Mutationen auf dem X-Chromosom bei Männern nicht durch ein anderes X-Chromosom kompensiert werden können, sind sie von den Auswirkungen besonders betroffen.
• Heterozygote Frauen sind hingegen meist nur Überträgerinnen (Konduktorinnen) der Krankheitsdisposition, sie übertragen das Merkmal auf 50% ihrer Söhne, während 50% ihrer Töchter ihrerseits Konduktorinnen sind. Eine Konduktorin erkrankt selbst nicht.
• Homozygote Frauen hingegen erkranken selbst und alle männlichen Nachkommen, die das defekte Gen von ihrer homozygoten Mutter geerbt haben, erkranken ebenso. 
• Insgesamt sind Männer viel häufiger als Frauen betroffen.

Criss-Cross-Inheritance:

Transmission of a gene from mother to son or father to daughter. Affected males: usually no affected daughters, but carriers and no affected sons. Unaffected carrier females: 50% of sons will be affected, 50% of daughters carriers. 

X-chromosomal dominanter Erbgang:

• Allgemein sind X-chromosomal dominant vererbte Erkrankungen selten. Da die genetische Information auf dem X-Chromosom liegt, wird sie geschlechtsgebunden vererbt.
• Ist ein Mann betroffen, sind dessen Söhne, die nur sein Y-Chromosom erben, merkmalsfrei, Töchter werden jedoch mit Sicherheit die Krankheitsdisposition erben.
• Ist eine Frau betroffen, ist jedes ihrer Kinder mit einer Wahrscheinlichkeit von 50% ebenfalls betroffen. 
• Insgesamt sind Frauen viel häufiger als Männer von einer X-chromosomal-dominanten Erkrankung betroffen.

• Law of Dominance and Uniformity

Parents are homozygous (pure-bred) => All offspring in the F1 are equal in genotype and phenotype showing the dominant trait. 

• Law of Segregation

Two heterozygous parents for a certain trait => offspring differ in genotype and phenotype.

Dominant-recessive inheritance:

- Phenotypic ratio 3:1

- Genotypic ratio 1:2:1

Intermediate inheritance:

- Phenotypic ratio = Genotypic ratio 1:2:1

• Law of independent assortment

Dihybrid cross experiment with 2 separate traits => new phenotypes & trait combinations

Alleles for separate traits are passed independently => Mendel's assumption: Loci are on different chromosomes => Deviations from this principle due to genetic linkage

Ratio = 9:3:3:1 

• komplettes Gen entfernen
• Kozak Sequenz deletieren/ modifizieren
• (nur Promotor modifizieren kann noch schwache Expression hervorrufen)

• Homologe Rekombination/Gen-Targeting
• Zellvermittelte Transgenese (cell mediated transgenesis)

• Verschieben von vorteilhaften Gen/Allelen zwischen Rassen
• Verschieben von vorteilhaften Gen/Allelen zwischen Arten
• Verbesserung von Merkmalen, die für die genetische Selektion schwierig sind z. B. Krankheitsresistenz (Bsp. Porcine reproductive and respiratory disease virus (PRRSV)