Analytische Chemie 2

Bei der Umkehrphasenchromatographie werden apolare stationäre Phasen eingesetzt.

Mit zunehmender Polarität des LM verbringen die beiden Analyten mehr Zeit in der mobilen Phase und wandern dadurch schneller durch die Säule. Dadurch resultiert eine geringere Auftrennung.

Analyt A hat eine hohe Polarität und wechselwirkt daher kaum mit der stationären Phase, weshalb sie schneller Retentiert wird. 

• Verteilungschromatographie: Die Retention wird durch Verteilungsgleichgewichte des Analyten zwischen der mobilen Phase und der stationären Phase bestimmt.
• Adsorptionschromatographie: Die Retention wird durch Adsorptionsvorgänge der Analytmoleküle an die Oberfläche der stationären Phase beeinflusst.
• Ionenaustausch-Chromatographie: Zur Retention von Analyten werden Ionentauschgleichgewichte ausgenutzt. In der stationären Phase sind Ladungen immobilisiert, die mit den Analytmolekülen wechselwirken können.
• Ausschlusschromatographie: Die Analytmoleküle werden aufgrund ihrer Molekülgrösse stärker oder schwächer in den Poren der stationären Phase zurückgehalten.

An Silicagel-Trägern können funktionelle Gruppen kovalent gebunden werden. Dadurch lassen sich die Eigenschaften der stationären Phase genau einstellen. Es können dabei polare oder apolare Gruppen gebunden werden.

Bei der Behandlung der Silicagel-Oberfläche mit langern Alkanen können die Bindungsstellen durch sterische HInderung teilweise nicht besetzt werden. Beim End-Capping werden deshalb kurze Alkane (z.B. Methylgruppen) an die Oberfläche gebunden, wodurch keine polaren Wechselwirkungen mehr möglich sind.

• Polarität verändern, damit eine Verteilungssäule statt einer Adorptions- oder Ionenaustauschersäule benutzt werden kann
• Empfindlichkeit aller Probekomponenten zu erhöhen
• Empfindlichkeit für einen bestimmten Analyten zu erhöhen

Der ionischer Analyt wird mit einem organischen Stoff mit entgegengesetzter Ladung zu einem ungeladenen Ionenpaar. Er lässt sich dadurch mit Umkehrphasenchrom. bestimmen. 

Durch LM, die nur schwach mit der stationären Phase wechselwirken, werden die Analyten nur selten von ihren Bindungsstellen an der stationären Phase verdrängt. Dadurch verlängert sich die Retentionszeit und während sich die Auflösung erhöht.

Bei der Normalphasenchromatographie werden zuerst die apolaren Moleküle den Detektor erreichen, bevor die polaren Moleküle dies tun.

Bei der Umkehrphasenchromatographie werden zuerst die polaren Moleküle den Detektor erreichen, bevor die apolaren Moleküle dies tun.

Kürzere Retentionszeiten, da sich der (apolare) Analyt gut im LM löst.

Bei der Ionenaustauschchromatographie trägt die stationäre Phase eine elektrische Ladung. Bei Kationentauschern wird dabei oft SO₃^- eingesetzt. Das Probeion verdrängt während der Chromatographie das positiv geladenen Kation/Gegenion von seiner Bindungsstelle mit der stationären Phase, dabei wird das Probeion retentiert.

• Konkurrenz zwischen Probeionen und Pufferionen (Gleichgewicht K1)
• Basenstärke der Probe (Komplexbildung zwischen Probeion und OH^- Ionen)
• Säuresträrke des Kationentauschers (je höher der pH, desto mehr H⁺ können die Probeionen verdrängen, bevorzugt ist eine geringe Affinität zu H⁺-Ionen)

• Hohe Ladung des Probeions (+1 sind schwächer Affin als +2 geladene Ionen)
• Kleiner Ionenradius (je grösser das Ion, desto kleiner die Hydrathülle, je grösser die Hydrathülle, desto tiefer ist die Anziehungskraft)
• Grosse Polarisierbarkeit des Probeions

Bei einer Suppressions-Chromatographie werden Ionen, die in einem Puffer, der die Probemoleküle enthält, vorhanden sind, neutralisiert, sodass sie nicht mehr vom Leitfähigkeitssensor erkannt werden können. Dadurch lässt sich das Hintergrundrauschen unterdrücken.

• Erhöhte Pufferionenstärke verkleinert die Retentionszeit: Es sind mehr Pufferionen in der mobilen Phase, die die Probeionen von den Bindungsstellen verdrängen können. (K1)
• Erhöhung des pH's kann sich äussern in:
  • Abnehmen der Retentionszeit: Komlexbildung zwischen H+ und Probeion ist möglich, kann keine weitere WW mit der stat. Phase eingehen
  • Vergrössern der Retentionszeit: bei schwachen Kationentauschern

Für Kationentauscher (wenn also Kationen analysiert werden) werden als Suppressorsäulen mit OH- beladene Anionentauscher eingesetzt und vice versa. Dabei werden die Probeionen in der ersten Säule aufgetrennt, bevor sie von der Suppressorsäule vom Hintergrundrauschen befreit werden.

• Säule sollte möglichst ähnliche Polarität wie das Probemolekül aufweisen
• Mobile Phase sollte in der Polarität möglichst unähnlich sein 

Achtung: bei extremfällen führt diese Auswahl zu extrem langen Retentionszeiten.

\(k'_2 = 10^{P'_2 - P'1 \over 2} \cdot k'_1\)

k'_2 = Endwert des Retentionsfaktores für den (einzelnen) Analyten

P'_2 = Endwert des Polaritätsindexes der mobilen Phase

k'_1 = Ausgangswert des Retentionsfaktors für den Analyten

P'_1 = Ausgangswert des Polaritätsindexes der mobilen Phase

Um den Retentionsfaktor k' zu verändern werden oft die Anteile der entsprechenden LM's verändert (z.B. von 30:70 Ethanol:Wasser zu 60:40 Ethanol:Wasser). 

Um den Trennfaktor alpha zu verbessern, wird die Zusammensetzung der mobilen Phase verändert. Dabei sollte k' möglichst gleich bleiben. Um möglichst verschiedene LM (unterschiedliche selektivitätsbestimmende Eigenschaften) auswählen zu können, eignet sich das Selektivitätsdreieck. LM, die im Selektivitätsdreieck nahe beieinander liegen, haben sehr ähnliche Eigenschaften, weshalb sie sich nicht gut als Substituenten eignen. 

Ein HPLC-Gerät besteht aus: 

• System für LM-Versorgung
• Pumpe
• Injektor
• Säule(n)
• Detektor
• Datererfassungs- und Steuerungseinheit

Luftblasen in der Säule können zu einer verrutschten Basislinie oder zusätzlichen Peaks führen. Entgast wird entweder offline unter Vakuum in einem Ultraschallbad oder mit einem Intertgas mit schlechterer Löslichkeit.

• Generierung von hohen Drücken
• Konstante Förderleistung mit geringer Pulsation
• Chemische Resistenz

Durch die assymetrische Nockenwelle ist eine beinahe pulsationsfreie Förderung möglich. 

Injektoren können 6-Wege Ventile sein, die die Probe und das LM-Gemisch normalerweise voneinander trennen. Bei der Injektion wird das Ventil umgelegt, sodass die Probe in die Säule gespiesen wird. Wenn hohe Präzision gefragt ist (wenn also ohne Internen Standard gearbeitet wird) werden pneumatische Injektionssysteme bevorzugt.

• Opfersäulen: Konditionieren das LM, damit es beim Eintritt in die Trennsäule bereits mit Kieselsäure gesättigt ist -> erhöht Lebensdauer der Trennsäule, sind vor dem Injektor platziert
• Schutzsäule: halten Verunreinigungen auf, sind aus ähnlichem oder identischen stationären Phase aufgebaut. Befinden sihc zwischen Injektor und Trennsäule

• bessere Trennleistung bei gleichbleibender Analysezeit
• hohe Drücke sind notwendig, um den Widerstand zu überwinden

• Retentionsvolumen nimmt quadratisch ab, wenn der Durchmesser halbiert wird -> weniger Lm benötigt
• Konzentration steigt quadratisch, wenn der Durchmesser halbiert wird -> weniger Verdünnung, höhere Empfindlichkeit

• Gleiche Emfindlichkeit für alle Probemoleküle
• Keine Beeinflussung durch unspezifische Effekte (Temperatur, LM-Zusammensetzung)
• Grosser Linearer Bereich, tiefe Nachweisgrenze
• Keine Bandenverbreiterung durch Totvolumen oder langsame Datenraten
• Schnelle Ansprechzeit

• am häufigsten angewandt
• die meisten organischen Verbindungen absorbieren Licht, je mehr DB, desto höher die Wellenlänge der Absorption
• mobile Phase darf keine Absorption bei der gewählten Wellenlänge aufweisen
• Durchstrahlung in Längsrichtung (Lambert-Beer)
• Durch die Kombination von verschiedenen Lampen lässt sich das gesamte Spektrum abdecken

• gesamtes Spektrum wird analysiert
• auch schlecht aufgelöste Peaks lassen sich quantifizieren, wenn die Absorptionsspektren eines Stoffes bekannt sind
• Durch das Verhältnis zweier Absorptionen lassen sich verunreinigungen detektieren
• durch die Subtraktion zweier Wellenlängen kann der Basisliniendrift verringert werden (va. bei Gradientenelution ein Problem)

Die Veränderung des Brechungsindexes des Analyt-LM und des reinen LM kann quantifiziert werden. Das Detektionslimit liegt aber weitaus höher als das der UV-Detektion.

Bei der Fluoreszenzdetektion wird die Probe mit Licht einer fixen Wellenlänge angestrahlt. Die Emission wird dabei gemessen und gibt (bei Fluoreszierenden Stoffen) Aufschluss über die Menge. Detentionslimit liegt um 1000 Fach tiefer als bei UV-Detektion.