Molekularbiologische Techniken

Baupläne der körpereigenen Proteine sind im Erbgut – in der DNA im Zellkern – gespeichert. Sie werden dort in mRNA umgeschrieben. Ist die mRNA mit dem Bauplan für ein Protein gebildet, verlässt sie den Zellkern. Ausserhalb des Zellkerns lesen dann sogenannte Ribosomen diesen Bauplan ab und stellen das entsprechende Protein her. 

Es kommen mehr als hunderttausend solcher mRNAs gleichzeitig in einer menschlichen Zelle vor. Die Ribosomen können die Informationen nur während einer begrenzten Zeit ablesen, da die mRNAs normalerweise nach einigen Minuten bis Stunden wieder abgebaut werden. Eine mRNA, und damit der Bauplan für jedes gewünschte Protein, lässt sich auch im Labor künstlich herstellen. Dieses Verfahren nutzen Impfstoffhersteller bei der Entwicklung der mRNA-Impfstoffe.

Die Transfer-RNA (=kurze Ribonukleinsäurestränge) liefert die passenden Aminosäuren, um während der Translation von der DNA abgelesene Sequenzen in Polypeptidketten umzuwandeln. Sie besitzt die Andockstellen für genau drei Basen, die jeweils genau passend für eine Aminosäure sind.

=Herstellung eines Proteins oder Polypeptids in Lebewesen durch die Umsetzung der in der DNA gespeicherten Informationen.  

Als Genexpression bezeichnet man die Bildung eines von einem Gen kodierten Genprodukts, vor allem von Proteinen oder RNA-Molekülen. Die Genexpressionbesteht aus mehreren Einzelvorgängen. Dazu zählen Transkription, Spleißen, Translation und posttranslationale Modifikation sowie deren Regulationsmechanismen.

In einer Zelle werden nur ganz bestimmte Gene gebraucht und nur diese werden „angeschaltet“. Diese Aktivierung von Genen zur Anfertigung der dazugehörigen Proteine wird als Expression bezeichnet. Welche Aufgabe eine Zelle im Organismus übernimmt, hängt von den Genen ab, die in ihr exprimiert werden.

"Intervening regions" = nicht codierenden Abschnitte der DNA innerhalb eines Gens.

Trennen die benachbarte Exons, die codierenden Abschnitte der DNA, voneinander ab. Introns werden transkribiert, aber dann aus der prä-mRNA herausgespleißt, bevor diese zur Translation aus dem Zellkern herausgeschleust wird. Die Aufteilung des Gens in Intron und Exon gehören zu den Hauptcharakteristika von eukaryotischenZellen.

Ribonukleasen = Enzyme, die die hydrolytische Spaltung von Phosphodiesterbindungen in Ribonukleinsäure(RNA)-Ketten katalysieren.

• gehören zu Nukleasen
• Einteilung nach Angriffspunkt & Reaktionsprodukt 
• Geschieht Spaltung inmitten der RNA-Kette handelt es sich um Endiribonukleasen
• Exoribonukleasen greifen die spezifischen Enden der RNA-Kette an
• Reaktion ist Teil der Prozessierung und des Abbaus von RNA. 
• Bestandteil des zellulären Stoffwechsels 
• Menschen etwa 50 RNasen
• teilweise aus mehreren Untereinheiten bestehen =Proteinkomplexe
• 9 menschliche RNasen mit seltenen Erbkrankheiten assoziiert.

• aus einzelnen Bausteinen den Nucleotiden aufgebaute Makromoleküle 
• enthalten bei allen Organismen die genetische Information
• Abwechselnde Einfachzucker & Phosphorsäurester bilder eine Kette, wobei an jedem Zucker 1 Nukleinsäure hängt

• = Desoxyribonukleinsäure
• Doppelsträngig
• speichert die Erbinformationen 
• Säure
• Nukleinsäuren, da sie sich überwiegend im Zellkern befinden

• = Ribonukleinsäure
• Einzelsträngige, fadenförmige amakromoleküle im Zellkern & im Zytollasma von Zellen
• Proteinbiosynthese - liefern Bauanleitung für Proteine
• an Übertragung & Umsetzung der Erbinformation beteiligt 
• Säure
• Da sie sich überwiegend im Zellkern befinden, werden sie Nukleinsäuren genannt

• kleine runde Teilchen
• Proteine zur Verpackung der DNA          = Spulen um die sich DNA wickeln kann

• Proteinkomplexe
• wirken als Enzyme beim Aufbau des strangförmigen Polymers einer Ribonukleinsäure (RNA) aus ihren Grundbausteinen (Ribonukleotide) mit.
• Diese aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzten Polymerasen werden danach unterschieden, ob sie für ihre Wirkung bei der Synthese eines RNA-Stranges von der Vorlage einer Matrize aus DNA oder RNA abhängig sind oder nicht. 
• DNA-abhängige RNA-Polymerasen spielen eine wesentliche Rolle bei der Transkription und kommen daher in allen Lebewesen vor.

• Steril
• Filter
• "low-retentiom" Funktion

Vorhandensein von einer oder mehreren kernhaltigen Zellen

• normalerweise wird ein grosses EDTA-Blutröhrchen von einer venösen Blutentnahme verwendet
• Damit Blut gut gemischt ist & man genügend Zellen für die Extraktion hat, muss das Röhrchen vor dem Pipettierschritt mehrmals invertieren (=umkehren/umstellen) werden

Generiert Informationen bezüglich der Konzentration (Menge) der extrahierten DNA & Informationen bezüglich der Reinheit (Verhältnis zwischen DNA & Proteinen) der extrahierten DNA

• Bestimmung erfolgt im NanoDrop im UV Bereich
• Absorptionsmaximum der DNA & RNA liegt bei 260nm, Proteine bei 280nm

OD260nm                                                       OD280nm   = Ratio 1.7-2.0

Reinheit zwischen 1.7&2.0 darf mit der DNA weitergearbeitet werden

Tiefere Werte = zu viele Proteine haften an der DNA, stören später die Arbeit der Enzyme in einer PCR (Polymerasen Kettenreaktion)

Zu hohe Werte = Salzkristalle aus den Waschlösungen sind vorhanden, stören weitere Reaktionen

Wert knapp unter 1.7 spezielles Probematerial, das nicht einfach so nachbestellt werden kann, so wird in der Praxis z.T. trotzdem weitergearbeitet, dazu ist es aber nötig das PCR gut funktioniert.

• BR1, BR2, BR3, BR4, BR5 RT
• PROTK (Proteinase K) RT
• EtOH (Ethanol) 4°C
• RNFW (RNase free water) RT

55°C & 65°C

RNasen kommen überall vor, dies sind Enzyme, die RNAs enzymatisch abbauen & somit zerstören können.

• Vor Aufbereitung muss Patientenprobe mindestens 2h bei RT gelagert werden, damit Zellen effizient lysiert werden
• Eingefrorene Proben: auftauen lassen, 10x kippen, dann 2h bei RT equilibrieren (="ins Gleichgewicht bringen") 

OD260nm                                                       OD280nm = Ratio 1.8-2.2

• Reagenz schützt RNA-Molekül vor Abbau durch RNasen
• reduziert ex-vivo-Veränderungen der Genexpression auf ein Minimum

Reinheit zwischen 1.8 & 2.2 darf mit RNA weiterverarbeitet werden

Tiefere Werte = zu viele Proteine haften an RNA stören später Arbeit der Enzyme in einer RT-PCR (Reverse Transkriptase Polymerasen Kettenreaktion)

Zu hohe Werte = Salzkristalle aus Waschlösungen sind vorhanden, stören weitere Reaktionen

Wert knapp unter 1.8 & spezielles Probematerial, welches man nich einfach so nachbestellen kann, so wird in der Praxis z.T. trotzdem weitergearbeitet. Dazu ist es aber nötig dass RT-PCR gut funktioniert.

(RT = Reverse Transkriptase)

RNase

Einzelsträngig

Proteinbiosynthese 

PAXgene

1) Menschliche RNA wird extrahiert um Informationen zum Transkriptom (Genexpression) zu er- halten. Dabei handelt es sich um Genexpressionsanalysen. RNA wird extrahiert – mit einer Re- versen Transkriptase Reaktion in cDNA umgeschrieben und anschliessend steht die cDNA für di- verse Methoden zur Verfügung, z.B. qualitative PCR, quantitative PCR, Microarrays usw.

2) Weiter kann virale RNA aus menschlichen Zellen extrahiert werden um die Viren nachzuweisen, resp. um sie zu identifizieren. Auch hier wird die RNA extrahiert und in cDNA umgeschrieben für die weiteren Analysen. (Aktuelle Coronavirus-Situation)
 

3) Eine weitere Anwendung in der Praxis (v.a. Forschung) ist das Erstellen einer cDNA-Bank. Ei- ne cDNA-Bibliothek, auch cDNA-Bank, ist eine Sammlung von vielen cDNAs, die aus der mRNA einer bestimmten Zelle oder eines Gewebes isoliert und umgeschrieben wurde und repräsen- tiert im Idealfall die Gesamtheit aller exprimierten Gene, das Transkriptom, der untersuchten Probe.
 

siehe Abbild

• BR1 Resuspendierugspuffer             (Pellet lösen)
• BR2 Bindungspuffer (AL Puffer)
• BR3 Waschpuffer 1 = chaotrope Salze (AW1) 
• BR4 Waschpuffer 2 = chaotrope Salze Ethanol (AW2)
• BR5 Elutionspuffer (AE)

zerkleinert alle Zellbestandteile, nur DNA & RNA können durch

zum binden der RNA