Metabolic Engineering und Naturstoffproduktion

Es entsteht jeweils Enzym-H und

H2O: Carbonsäure

R-OH: Ester

R-NH2: Amid/Amine

H2O2: Peroxysäure

Ein Enantiomer eines Racemats wird von einem Enzym deutlich schneller umgesetzt als das andere. Durch die kinetische Bevorzugung des einen, bleibt das andere Enantiomer unverändert zurück. Nun kann das enantiomerenreine Produkt abgetrennt werden.

Beispiel: Amidase spaltet bei einem racemischen Gemisch von L-AS-Amid und D-AS-Amid nur die natürlich vorkommende L-Form.

Glutamat wird in großen Mengen als Geschmacksverstärker benötigt.

Produktion: durch Corynebakterium Glutamicum-Mutante, die eine gesteigerte Aktivität der PEP-Carboxylase (reduziertes Feedback-Inhibition durch L-Glutamat), der Glutamat-DH, der Isocitrat-Lyase und der Malat-Synthetase zeigt.

• Nitrilasen hydrolisieren 2 mal (addieren 2 mal Wassermoleküle hinzu) und es entsteht eine Carbonsäure.
• Nitril-Hydratasen hydrolisieren nur einmal und daraus resultierende Amid wird von einer Amidase zu einer Carbonsäure hydrolysiert. 
• Nitrilasen hydrolisieren v.a. aromatische heterocyclische und ungesättigte aliphatische Nitrile, wobei Nitril-Hydratasen v.a. gesättigte aliphatische Nitrile hydrolisieren. 

• Formiat DH (im Industriemaßstab)
• Alkohol DH (schlechte Umsatzrate und Deaktivierung von Enzymen durch Ethanol und Acetaldehyd => wird nicht oft verwendet)
• Glucose DH bzw. Glucose-6-Phosphat DH (ird auch nicht oft verwendet)

Lipoxygenasen gehören zur Gruppe der Dioxygenasen. Sie sind Enzyme, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit zwei Sauerstoffatomen zu Eicosanoiden oxidieren. Lipoxygenasen erkennen nicht konjugierte 1,4-Pentadiensysteme und hängen an das lezte C, das noch zum Pentadiensystem gehöhrt, O2 dran. Dabei entsteht aus einem nicht konjugierten 1,4-Pentadien-System ein konjugiertes 2,4-Dien.

Sie spielen bei der alternativer biochemischer Abbaumechanismus für Fettsäuren eine wichtige Rolle. 

Der Peptidsüßstoff Aspartam (L-Asp-L-Phe-OMe) hat die 200-fache Süßkraft von Saccharose. Bei der Reaktion findet eine kinetische Racematspaltung des D,L-Phe-OMe Racemats statt (Bevorzugung von L-Phe-OMe). 

Zuerst setzt Thermolysin im organischen Lösungsmittel (Isoamylalkohol) Z-L-Asparaginsäure enantioselektiv mit L- Phenylalanin-OMe zu einem Peptid um. Die unnatürliche L-Aminosäure wird durch ein nicht näher beschriebenes Verfahren wieder racemersisiert. Anschließend wird nach einer Aufreinigung die Schutzgruppe Z entfernt.

Für die kovalente Quervernetzung von Enzymen werden bivalente Reagenzien, also Reagenzien die an zwei Stellen andere Moleküle binden können, benötigt. Die Enzyme werden entweder mit sich selbst vernetzt, Cross-Linking genannt, oder mit anderen Füllproteinen z.B. Albumin zwischen den einzelenen Enzymen vernetzt, Co-Cross-Linking gennant.

Eine einfache Methode ist die Ausbildung von Gelatiene-ähnlichen Aggregaten. Diesen  Zustand kann man durch Ausbildung vernetzer Enyzmkristalle, Cross-linked enzyme crystals (CLECs), erreichen. Hierbei wird das bifunktionelle (Zwei funktionelle Gruppen) Aggenz Glutaraldehyde verwendet, welche die Proteine über Lysin Seitenketten quervernetzt. Hierbei entstehen Schiffsche Basen (Enzym-N=C). Die Proteine sind also über Schiffsche Basen miteinader verbunden.

Vorteil: erhoehte Stabilitaet

CLECs sind Aggregate aus kovalent verbundenen Enzymen. Das Quervernetzen (oder crosslinking) geschieht durch ein bifunktionales Reagenz (sog. Crosslinker). Enzyme sind schwierig wieder zu gewinnen und haben oft eine geringe Toleranz bezüglich Substrat-bzw. Produktkonzentration (Produktinhibition). Die Immobilisierung und kontinuierliche Produkternte bringt hier Abhilfe.

1. Oxidation der Glucose zum Gluconolacton durch die Glucoseoxidase

2. Selbstständige Hydrolyse des Lactons zur Gluconsäure

3. Das bei der Oxidation verbrauchte FAD wird durch O2 regeneriert. Das entstehende H2O2 wird von der Catalase zersetzt

• Hydrolyse und Seperation der Proteine
• Fermentation der Glucose und andere Kohlenstoffquellen
• Synthese aus chemische Rohstoffe mittels Enzyme oder Zellreaktor
• Chemische Synthese aus Rohstoffe

Vitamin C= Ascorbinsäure

Vitamin B2= Riboflavin

Vitamin B12= Cyanocobalamin

=> alle anderem Vitamine werden synthethisch hergestellt. 

• Xanthan: Produktionsprozess => Der Produktionsstamm X.campestris (Pflanzenpathogen) wird mit Glucose oder Saccharose und einer Stickstoffquelle vorkultiviert. 
• Dextran: Produktionsprozess => Die Produktion erfolgt durch Leuconostroc mesenteroides bei 23°C und Saccharose als Zuckerquelle für die Mikroorganismen und Substrat für die Reaktion.

Bt Mais ist eine gentechnisch veränderte Maissorte, die das Gen für das Toxin des Bakteriums Bacillus thuringiensis (Bt-Toxin) trägt. Dieses Gen codiert für eine Toxinvorstufe, die erst im Maiszünsler toxisch wird und für andere Organismen unschädlich ist. Damit wird die Maisschaedling bekaempft/getoetet.

1 I.U. (International Unit):= 1 μmol Produkt (Substrat) pro 1 Minute

Turnover number (Wechselzahl):= Anzahl Substratmoleküle, die ein Enzym in einer bestimmten Zeit (meißt 1 sec) umsetzen kann (meißt 10-1000)

Grüne Biotechnologie: der Zweig der Biotechnologie, der sich mit den Pflanzen befasst (Pflanzenbiotechnologie). Sie bedient sich moderner Methoden, um Nutzpflanzen zu verbessern, pflanzliche Inhaltsstoffe zu gewinnen oder um pflanzliche Enzyme bzw. Wirkprinzipien (Bionik) für neue Anwendungsbereiche zu erschließen.

Rote Biotechnologie: umfasst die Bereiche der Biotechnologie, die sich mit der Entwicklung therapeutischer und diagnostischer Verfahren befassen – von Biochips zur medizinischen Diagnostik über die personalisierte Medizin bis hin zur Arzneimittelherstellung und Gentherapie.

Blaue Biotechnologie: Anwendung der Methoden der Biotechnologie auf Lebewesen aus dem Meer bzw. grundsätzlich wasserlebende Organismen

Weiße Biotechnologie: der Bereich der Biotechnologie, der biotechnologische Methoden für industrielle Produktionsverfahren einsetzt.

Graue Biotechnologie: umfasst alle biotechnologischen Verfahren zur Aufbereitung von Trinkwasser, Reinigung von Abwasser, Behandlung von Abfällen, Sanierung kontaminierter Böden und Abluft- bzw. Abgasreinigung.

Braune Biotechnologie: Technische/Umwelt-Biotechnologie

Gelbe Biotechnologie: Herstellung von Lebensmitteln und Grundstoffen

Herstellungsverfahren: Hydrolyse von Proteine, Fermentation der Glucose oder andere Kohlenstoffquellen, chemische Synthese aus Rohstofe, enzymatische Umsetzung aus chemische Rohstoffe (& Zellreaktor)

Beispiele für die Verwendung:

- Geschmacksverstärker (Glutamat)

- Futterzusatz (Lysin, Methionin, Tryptophan, Threonin)

- Aspartam-produktion (Aspartat, Phenylalanin)

- Süßstoff (Glycin)

- Medizin/Kosmetik (Arginin,...)

- Pflanzenschutzmittel

Peroxidasen sind Enzyme, welche die Reduktion von Peroxiden (meist Wasserstoffperoxid) katalysieren.

Meerettich - Peroxidase kann neben Wasserstoffperoxid auch andere Peroxide enantio- selektiv reduzieren. Hierfür braucht es einen Elektronen- und Wasserstoff-Donor, den es oxidieren kann. Als Donor wird meistens der Aromastoff Guajakol genommen, der durch die Reaktion oligomiert wird.

Substrat: Fumarsaeure

LM-Zusatzstoff: Aspartam (L-Asp-L-Phe-OMe)

Enzym: L-Aspartase wird in Methylierter Form eingesetzt

Die regioselektive Oxidation von D-Sorbitol zu L-Sorbose wird von Acetobacter Suboxidans geleistet.

Vorteile: regioselektive Oxidation von nur einer der endständigen OH-Funktionen (chemisch würden hier mehrere Schutzgruppen benötigt)

Cyclodextrine werden biotechnologisch durch den enzymatischen Abbau von Stärke, etwa aus Mais oder Kartoffeln, hergestellt. Die hierfür eingesetzten Enzyme werden als Cyclodextrin-Glycosyltransferasen, kurz CGTasen bezeichnet. Diese sind verschiedenen Bakterien und Archaeen zu finden, wobei industriell die aus dem Bacillus macerans isolierten CGTasen am bedeutsamsten sind. Bei der Einwirkung auf Stärke schneidet die CGTase aus der helikal gewundenen Struktur des Kohlenhydrats einzelne Stücke heraus und verbindet diese zu einem ringförmigen Oligosaccharid – dem Cyclodextrin.

• Aus dem Abbau von Stärke mit alpha-Amylase erhaltene Maltodextrine werden mit Hilfe der Cyclomaltodextringlucano-transferase aus Bacillus macerans Cyclodextrine aus 6-12 Glucose-Einheiten erzeugt (Hauptprodukt: beta-Cyclodextrin (7 Glc-Einheiten).

Verwendung: Stabilisierung von Vitaminen und Aromastoffen, geschmackliche Neutralisierung von Bitterstoffen

Ein Aminosäure-Anitbiothikium ist L-Phosphinotricin. Wobei dieses v.a. als Pflanzenschutz- mittel eingesetzt wird und unter dem Namen Glufosinat besser bekannt ist. 

Aufgrund seiner Ähnlichkeit mit Glutaminsäure hemmt L-Phosphinotricin die Glutamin-Synthethase, welche bei L-Glutaminsäure die Hydroxygruppe durch Ammoniak substituiert und dadurch Glutamin entsteht. Durch die Hemmung kommt es zur Anreicherung von Ammoniak in der Zelle und die Pflanzenzelle stirbt ab. Das Herbizit ist also an sich unselektiv. Durch genetisches Einbringen des Gens für für das Enzym Phosphinothricin- Acetyl-Transferase (PAT-Enzym) in Pflanzen, können die Pflanzen Resistent gemacht werden.

• Phosphinotricin ist ein Strukturanalogon zu Glutaminsäure.
• Phosphinotricin hemmt die Glutaminsynthetase (normalerweise Feedbackinhibierung durch Glutamin).
• Dadurch reichert sich NH3 an , welche toxisch ist.
• Transformierte Pflanzen bekommen das Gen für die Phosphinotricin acetyltransferase, welche die Aminogruppe von Phosphinotricin acetyliert und das Antibiotikum somit unschädlich macht.

• Ausbeute erhöht: keine aufwendige Extraktion aus dem wässrigen LM, keine Emulsion, niedrig siedende Lösungsmittel
• Unpolare Substrate werden besser umgesetzt wegen erhöhter Löslichkeit (somit stehen sie in größerer Konzentration zur Verfügung)
• Mikrobielle Kontamination ist vernachlässigbar (Industriemaßstab)
• Nebenreaktionen wie Hydrolysen, Razemisierung, etc. sind unterdrückt
• Enzyme können durch einfache Filtration abgetrennt werden, da sie heterogen dispergiert sind
• Erhöhte Stabilität der Enzyme (Denaturierung durch hydrolytische Prozesse erniedrigt)
• Erhöhte Substrat-, Regio-, und Enantioselektivität da Enzyme in organischen Lösungsmitteln, da sie nicht mehr so flexibel sind
• Verschiebung des thermodynamischen Gleichgewichts einer Hydrolysereaktion zugunsten der Synthesereaktion

Der in der Rückreaktion entstehende Ester R-CO-O-A wird bevorzugt in der R-konfigurierten Form entstehen. Der R-Ester scheint besser in die aktive Tasche zu passen als der S-Ester somit wird auch dies der bevorzugte Weg auf der Rückreaktion sein. 

Der Grund dafür ist Drei-Punkt Anheftungsregel. 

Pyruvat Carboxylase, Malat Dehydrogenase, Citrat Synthase

=> Erhöhung der Aktivitäten um mehr Vorläufer (Oxaloacetat durch Pyruvat-Carboxylase) herzustellen, so dass eine verstärkte Herstellung von Citrat (aus Oxalacetat durch Citrat Synthase) und verstärkte Herstellung von Malat (aus Oxalacetat durch Malat Dehydrogenase) stattfinden kann, (Citrat wird gegen Malat mittels Malat/Citrat-Antiporter aus Mitochondrium in Cytplasma transportiert und von Cytoplasma wird Citrat ins Medium ausgeschieden).

• Wenn viel Oxalacetat vorhanden ist, wird auch viel Citrat gebildet.
• Wenn viel Malat vorhanden ist, wird auch viel Citrat ins Medium abgegeben.
• Da Citrat immer wieder von Produktionsanlage entfernt/sammelt wird, sind diese Mutationen noetig, damit die Citratzyklus weiterlaeuft.

• keine Cofaktoren
• Vielzahl verfügbarer Enzyme
• günstig
• stabil
• auch für umgekehrte Reaktion (Ester-bzw. Amidsynthese) einsetzbar => in organischen Lösungsmitteln mit geringer Wasseraktivität

Die am häufigsten verwendete Esterase (Serin-Esterase). Sie hat eine hohe Selektivität für Carbonsäuren und ist ziemlich günstig.

• Hydrolyse prochiraler Ester (Enantioselektiv) 
• Trennung razemischer Ester
• Regio- und diastereoselektive Hydrolyse (bei zwei gleichen funktionelle Gruppen wird nur eine umgesetzt)
• Milde Hydrolyse, z.B. PLE hydrolysiert die Vorläufer von Prostaglandin E (Methylester) genau an der benötigten Stelle mild
• Trennung E/Z-Isomere (trans/cis) => nur der Ester in trans-Position wird hydrolysiert 

• Esterasen zeigen normale Michaelis-Menten-Kinetik, Lipasen aber nicht.
• Lipasen arbeiten an der Öl/Wasser Phasengrenze => Erst sobald genug Substrat vorliegt, damit sich Öltröpfchen (CMC) bilden, kommt es zu einer Umsetzung, da die Umsetzung nur an der Grenzfläche geschieht. 

Die Kritische Mizellbildungskonzentration, oder CMC (englisch critical micelle concentration) beschreibt  die Konzentration eines Tensids, ab der sich Mizellen bilden. Bei einer weiteren Erhöhung der Konzentration gehen nahezu alle hinzukommenden Moleküle in Mizellen über.

Kinasen katalysieren die regio-und enantioselektive Bildung von Phosphatestern unter Verbrauch von ATP als Cosubstrat. Dabei wird ATP durch Donorphosphat regeneriert. 

• Carbamat (zur Regenerierung von ATP) ist instabil. Ammoniak, das nach Umseztung entsteht, kann Mg ersezten, wodurch manche Enzyme deaktiviert werden. 
• PEP und Acetylphosphat werden als Donorphosphat verwendet. 

Hexokinase: Phosphorylierung der D-Glucose und seine Derivaten zu D-Glucose-6-Phosphat

Glycerol-Kinase: Phosphorylierung von Glycerol zu Glycerol-3-Phosphat

Acetat-Kinase: Phosphorylierung von Acetat zur Acetyl-CoA

Oxygenasen sind Enzyme, die ein oder mehrere Sauerstoffatome auf ihr Substrat übertragen, wobei oft auch Ringöffnungen am aromatischen Molekül stattfinden.

Mono-Oxygenase: 

• benötigen NADPH als Cofaktoren
• katalysierte Reaktionen: Hydroxylierung, Epoxydierung, Beayer-Villiger-Reaktion

Dioxygenase: 

• Bildung von Hydroperoxiden (Sub-O-O-H) durch Lipoxygenasen