Zellkulturtechnologie

• Mitogen wird aus Medium rausgenommen (Serumentzug, die Wachstumsfaktoren & Mitogene enthalten) => Kulturmedium rausnehmen & serumfreies Medium zugeben

Ohne Mitogene & Wachstumsfaktoren gehen die Zellen aus der Zellzyklus raus. Zellen akkumulieren in G1. Dann kann man den Versuch starten. 

• Zugabe von Inhibitoren des Zellzyklus, z.B. Nocodazol => Akkumulation in M-Phase; Aminopterin => Blockierung in S-Phase

Dabei akkumulieren nicht alle Phasen in einer Phase, trotzdem der Schwerpunkt liegt bei einer Phase. 

• Elutiation 

Zellen je nach Dichte separieren => entsprechend je nach Größe und Dichte eluiert. Nach der Zellzyklus verändern die Zellen ihre Größe => Zellen kann man die Zellen in G1-Phase isolieren. 

=> Zellschädigung verfassen

Apootose: Zelle & Nukleus kondensiert/schrumpft und fragmentiert. Plasmamebran schnürt enthüllte Fragmente des Cytosols (Organellen, Nukleus usw.). Sie werden in vivo von Immunzellen phagocytisiert => keine Entzündungsreaktion. 

Apoptose kann entweder wegen der Zellalterung (über extrinsische Signalweg, Todesrezeptoren) oder aufgrund von intrazellulären Schädigung entstehen (über intrinsische Signalweg). 

In vitro hat man bei der Apoptose irgendwann auch sowas wie Nekrose. Am Ende wird in der Zellkulturplatte irgendwelche Organellen rumschwimmen, da die membranümhüllten Blabbs nicht phagotyciert werden (=> Immunzellen fehlen) => Sekundäre Nekrose

ATP-Gehalt sinkt sehr stark bei der Apoptose. 

Signal: Bioluminiszenz

• ATP & O2 & Luficerase wandeln Luciferin in Oxlyluciferin um 
• Dabei wird Licht erzeugt und diese lässt sich verfassen

Je mehr ATP in der Zellen vorhanden ist, umso höher ist Signal. Tote Zellen produzieren entsprechend sehr geringe Signal. 

• Messbereich über 6 Größenordnungen
• Assay ist exrem sensitiv

Anschließend kann man auch den Anteil an ADP in der Zelle messen => ADP-Converting-Reagenz => frisch generierte ATP => Luciferase-Assay wiederholen.

Membran einer apoptotischen Zellen verändert sich. Membrankomponenten verändern ihre Lage (z.B. Phosphatidylserine, die in vitalen Zellen nach innen zeigen, flippen und zeigen außen bei der Apoptose). 

Diese extrazellulär exponierte Phosphatidyserine (PS) kann mittels Annexin erfasst werden. Diese markierte Annexin bindet selektiv an PS. Signal wird ausgelesen. 

Je mehr Annexin-Signal, desto mehr Zellen befinden sich in Apoptose. 

Färbung mit Propidiumiodid der membranenthüllten Vesikeln => zur Erfassung von sekundäre Nekrose.

Fluoreszenzmarkierte Caspase-Substrat => Sobald Caspase diese schneidet, dann wird diese Fluoreszenz von der Peptid frei => Fluoreszenz wird gemessen. 

Je mehr Signal, desto mehr Zellen befinden sich in der Apoptose. 

=> Ist Caspasekaskade aktiv?

Bei der Apoptose wird DNA fragmentiert und diese führt zu freien Nukleinsäure-Enden (3’-OH-Gruppen werden freigesetzt). Diese kann man mithilfe von einem Enzym, Deoxynucleotidtransferase, markieren. Diese markierte Enden kann mit BrdU verfasst werden. Gehalt an BrdU kann mit entsprechenden Antikörper gemessen werden (+ Fluoreszenz markiert).