Zellkulturtechnologie

spontane oder induzierte permanente phänotypische Änderung der Zellen, die durch vererbbare Änderung der DNA und Genexpression hervorgerufen wurde

• genetische Instabilität

Chromosomenanomalien, Variation der DNA-Menge

• Immortalität

Inaktivierung dominanter Seneszenzgene, die als negative Regulatoren im Zellzyklus sorgen, durch Mutation der Seneszenzgene oder Überkompensation durch Onkogene, welche ein Eintritt in Zellzyklus verursachen

• Wachstumsanomalien

Verlust der Zell-Zell- bzw. Zell-Substratadhäsion und Kontaktinhibition, reduzierte Serumabhängigkeit (aufgrund von der Produktion der Wachstumsfaktoren durch die Zellen selber; Sekretion autokriner GF), Überexpression von Onkogenen

• Malignität:= Bösartigkeit (schädlich)

Bildung invasiver Tumore nach Implantation in genetisch identische Wirtsorganismus oder Transplantation als Xenograft in immundefiziente Maus, Invasivität => diese invasive Zellen sind in der Lage, die Umgebung so zu stimulieren, dass neue Blutgefäße gebildet werden (Angiogenese)

Überang einer Zelle von begrenzter zur unbegrenzer Lebensdauer:

• Spontane Übergang

häufig bei Nagern, selten bei humanen Zellen, P = /

Sie können unendlich lange prolifieren, Zwischenstufen aufweisen oder sie können diese Fähigkeit zur dauerhaften Proliferation wieder verlieren => hängt von der genetische Instabilität der transformierten Zellen. 

• Aktive Immortalisierung durch:

Zellen wird auf der Genebene manipuliert, so dass mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit Mutationen auftreten, die dazu führen, dass Seneszenzgene inaktiviert oder Onkogengene aktiviert werden. 

carzinogene Chemikalien Bestrahlung (UV, Gamma)

Infektiom mit RNA/DNA-Viren, z.B. EBV

virale Onkogene, z.B. große T-Antigen aus SV40

Fusion mit Krebszelllinie, z.B. Hybridomtechnik bei der Produktion der monoklonaler Antikörper,

• Unterhalb der Filter wird die Zellen eingebracht.
• Diese Filter hat kleine Poren => die Zellen können nicht einfach durchdiffundieren und müssen durcharbeiten (cytoskeletale Änderung der Zellen).
• Dabei wird beobachtet, wie viel von diesen Zellen schaffen, auf die andere Seite der Membran durchzuarbeiten.
• Diese Zellen, die auf die andere Seite gelangen, werden erfasst und quantifiziert.
• Je mehr Zellen in der Lage sind, durchzuarbeiten, umso invasiver sind diese Zellen und umso höher wird die Malignität von dieser Zellen eingstuft.
• Man kann auch dabei nicht nur ein Filter, sondern auch ein ECM ins Spiel bringen, so dass die Zellen auch ECM-Strukturen durcharbeiten müssen.

Totipotent/Omnipotent:= Differenzierung zu allen Zellen des Embryos und extra-embryonale Gewebe/Zellen, z.B. Zygote bis 8-Zellstadium (Morula)

Pluripotent:= Differenzierung zu Zellen aller 3 Keimblätter (Körperzellen), z.B. Blastozyte

Multipotent:= können nur Zellen eines Keimblatts generieren (Organersatz) z.B. adulte Stammzellen

Oligopotent:= z.B. Vorläuferzellen, die sich in 2 Zelltypen differenzieren können

Unipotent:= die meisten ausdifferenzierten, somatischen Zelle

Nach der Teilung einer Stammzelle, gibt es 2 Möglichkeiten:

• Symmetrische Teilung: Es bildet sich 2 identische Stammzelle (Selbsterneuerung)
• Asymmetrische Teilung: Es bildet sich nur eine Stammzelle und die zweite Zelle ist weiter differenziert (keine Stammzelle mit niedrigeren Differenzierungspotential). 

Ursachen der assymetrischen Teilung:

• Ungleiche Verteilung der Differenzierungsfaktoren 
• Zelle wird nicht mittig geteilt, sondern asymmetrisch

=> bestimmte zelluläre Komponente stehen in einer der Tochterzellen in geringeren und in der anderen in höheren Maße zur Verfügung.

Endogene oder exogene Stimuli führen auch zur Gewebersatz (durch asymmetrische Teilung), wenn der entsprechende Bedarf da ist. 

Eigenschaften

• aus innerer Zellmasse der Blastocyte
• lebenslang teilungsfähig (Selbsterneuerung)
• pluripotent (können sich zu allen Körperzellen differenzieren)

Quellen: 

• Embryonale Stammzellen (aus der inneren Zellmasse der Blastocyte)
• primordiale Keimzellen (diploide pluripotente Zellen)

=> aus diesen embryonale Vorläuferzellen entwickeln sich die Keimzellen (Sperm, Oozyten)

• Stammzellen der Epiblast (Zellen aus dem Post-Implantat-Stadium, bei dem die Zellen immer noch die Pluripotenz besitzen)
• spermatogoniale Stammzellen

,iPS:

=> aus somatischen Zellen wird dabei pluripotente Zellen durch virale Transduktion erstellt 

4 Gene wurden überexprimiert:

• OCT3 und SOX2, welche identisch sind, für Transkriptionsfaktoren stehen und sind Pluripotenzmarker.
• KLF4 und c-Myc & NANOG und LIN28 => mittels Überexpression von dieser Gene wurden geschafft, aus Fibroblasten pluripotente Zellen zu herstellen. 
• iPS-Zelle wird genommen und in Blastocyte injiziert => Embryo entsteht. 

=> stellt ein Substitut gegen embroyonale Stammzellen 

Problem: Dabei wurde Onkogene (z.B. KLF4 und c-Myc) benutzt. Wenn Onkogene beteiligt und aktiviert sind, dann es nicht auszuschließen, dass es eine onkogene Einfluss vorhanden ist, der dazu führt, dass auch onkogene Mechanismen in dieser Zellen sich manifestieren. 

Maßnahmen: 

• Onkogene weglassen => Effizienz der Induktion ist aber entsprechend gering => Ausbeute an pluripotente Zellen, die man erhält ist gering. 
• Onkogene kann auch frühzeitig inaktiviert werden. 

Andere Verfahren zur Generierung von pluripotente Stammzellen aus differenzierten Zellen:

NT-ES Zellen: 

Kern einer somatischen Zelle wird in einer entkernten Eizelle gebracht. Daraus wird eine Blastocyte generiert. In der innere Zellmasse gibt’s die pluripotente Stammzellen. 

Zellfusion:

Dabei wird somatische Zellen mit eine embryonaler Stammzelle fusioniert => Hybridzelle.

2 Tests zur Ermittlung des Potentials: 

• in vivo-Test

Ausbildung von Teratoma (Keimzelltumor, die sich daher in Richtung aller dreier Keimblätter entwickeln kann):

In immunsupprimierete Mäuse (SCID-Mäuse) werden pluripotente Stammzellen injiziert. Dann wurde analysiert, wie sich diese Zellen entwickeln. Gewebestruktur, die sich aus diesen pluripotente Stammzellen gebildet hat, ist inhomogen und enthält Zelle aus allen Keimblätter => Mesoderm, Endoderm, Ectoderm. Diese Gewebe (Teratome) organisieren sich selbst zur typischen Strukturen, die man in unterschiedlichen Strukturen der Organe, die zur unterschiedlichen Keimblätter zugeordnet sind (Nachweis in-vivo). 

• in vitro-Test

Mithilfe von „Embryoid bodies“:

Dabei wird die pluripotente Stammzellen in ganz dichten Suspensionkultur (ohne Kontakt zu einer Oberfläche) gebracht. In Suspensionskultur heften sich die Stammzellen zusammen. Dann entwickeln sich kleine 3D-Geweben. Diese Gewebe beginnt sich durch den Kontakt zw. Zellen zu differenzieren => „Embryoid bodies“. 

Diese Körperchen bewegen sich bisschen, da dabei sich Herzmuskelzellen gebildet haben. Diese fangen an, sich rhymisch zusammenzuziehen.

Eigenschaften:

• nicht-differenzierte Zellen in differenziertem Gewebe
• lebenslang teilungsfähig (Selbsterneuerung)
• differenziert zu Zelltypen des umgebenden Gewebes => multipotent

HPC-Gewinnung: 

Aus peripherem Blut:

Die Zellen in Knochenmark wird durch ein Signalstoff (G-CSF) stumiliert, so dass die aus dem Knockenmark auswandern => Migration der hämatopoetische Zellen aus der Knochenmark in das periphere Blut. Durch Blutabnahme kann man diese HPC gewinnen. 

Vorteil: keine Narkose nötig, hohe Ausbeute an HPC

Aus Nabelschnurblut:

Vorteil: Abwehrreaktionen des Empfängers ist nicht so geprägt und sie proliferieren auch sehr gut.

• Dabei wird eine Blastocyt in Maus entwickelt. In der Diapause von Maus wird es entnommen (zwichen Blatocytenstadium und vor der Einnistung ins Schleimhaut).
• Danach wird die Blastocyte offen geschnitten.
• Die Zellen der inneren Masse wird in Kultur mit Wachstumsfaktoren, fetales Kälberserum, Monolayer von Murinen embryonalen Fibroblastenzellen (MEF-Zellen, wachstumsarretiert => wachsen nicht über) gebracht. Auf diesen MEF wird die Zellen der inneren Masse kultiviert. 

Entscheidend ist, dass diese MEF alle nötigen Stimuli für die embryonale Stammzellen von Maus abgeben, so dass die Stammzellen wachsen. 

Alternativ kann man auch mit einer Cytokin (LIF; Leukemie inhibitory factor) arbeiten. Dabei ist der Vorteil, dass dieser Cyotkin die Stammzellen besser festhält. 

Problem: Wenn diese Stammzellen wachsen, bleiben ein Teil der Stammzellen pluripotent und andere differenzieren sich. Dieses Kultur muss eng beobachtet und regelmäßig passagiert werden. 

• Man nimmt das Zellhaufen der pluripotente Stammzellen, dissoziert diese Zellen und überträgt diese in eine neue Kulturschale mit MEF oder LIF. 

Mithilfe der Morphologie oder durch Pluripotenzmarker (z.B. Oberflächenmarker) kann man untersuchen, welche die Stammzellen und welche die differenzierten Zellen sind. Dazu kann man FACS verwenden, um diese beide Zellen zu separieren. 

Durch die ständige Überprüfung kann man sicherstellen, dass guter Teil von diesen Zellen die Pluripotenz besitzen und Kultur dementsprechend dominiert. 

• Co-Kultur mit Feeder-Zellen (MEF) 

Fibroblasten der MEF sorgen dafür, dass keine spontane Differenzierung stattfindet und Pluripotenz beibehalten wird. 

• Supplementierung mit der LIF
• Wnt-Signalweg
• BMP
• Expression des Transkriptionsfaktors Oct-4, Nanog, Sox2 (um die Pluripotenz der Zellen zu untersützen)

Expressionlevel von diesen Faktoren liegt in einem bestimmten Bereich, damit diese embryonale Stammzellen erhalten. Wird der Oct-4 vermindert exprimiert, dann bildet sich Trophektoderm. Wird der Oct-4 stärker exprimiert, dann bilden sich extra-embryonales Entoderm oder ähnliches. 

=> Um diese Expressionslevel und Pluripotenz ständig aufrechtzuhalten, kann man die Stamzellen mit ein Plasmid, die diesen Transkriptionsfaktoren exprimiert, transfizieren. 

Problem: Expressionslevel genau zu kennen und nicht zur Überexpression kommen.

LIF bindet an Cyotkinrezeptor und LIF sorgt dafür, dass die STAT3 (Transkriptionsfaktor) aktiviert wird. Die Stimulation der STAT3 führt dazu, dass die Zellen in dieser Selbsterneuerungsmodus bleiben. 

Problem: Bei der LIF wird auch andere Signal-Transduktionswege/Proteine aktiviert => SHP-2-Interkation => Phosphatase (welche mit LIF auch aktiviert wird) sorgt dafür, dass die Phosphatreste der STAK3 (Andockmotive) wieder enfernt werden => STAT3-Effekt wird damit inhibiert. Damit wird die Selbsterneuerungsmodus reduziert. 

Hierbei wirken 2 Kräfte, die ausbalanciert werden müssen. Deswegen behält nur ein Teil der Zellen die pluripotente Status und andere Teil der Zellen werden differenziert. Dafür muss die Zellen regelmäßig aussortieren. 

Dieser ist normalerweise blockiert durch die GSK-3. Diese inhibiert ß-caterin und blockiert so den Signalweg. Man kann Inhibitoren gegen GSK3 ins Medium zugeben (BIO). Sie sorgt, dafür dass Signalweg aktiv wird und die Pluripotenzgene verstärkt exprimiert wird.

Dieses wirkt normalerweise zusammen mit LIF und aktiviert den Transkriptionsfaktor Smad, welche die Expression Id induziert. Id ist eine Inhibitor für die Differenzierung.  

=> Dopaminproduzierende Neuronen

• ES-Kultur mit FCS (fetale Kälberserum) und LIF => Proliferation/Vermehren undifferenzierter embryonale Stammzellen in vitro
• Passage von Kulturschale in einer dichter Suspensionskultur => Embryoid bodies 

Zellinteraktion führt zur Signalstoffaustausch und Signalgradienten => induziert Differenzierung in allen 3 Keimbahnrichtungen. 

• Sobald die Embryoid bodies gebildet sind, wird die Zellen in einer neuer Kulturschale gebracht => Selektion von Nestin-(+)-Zellen in ITSFn-Medium (Insulin, Transferrin, Selenit, Fibronectin; serumfreies Medium) => um Neuronen zu differenzieren

Hier sterben die meisten Zellen ab, aber Nestin exprimierende Zellen überleben hier und werden angereichert. 

Nestin: intermediäres Filamentprotein, Marker u.a. für neuronale und pankreatische Vorläuferzellen. 

Hierbei wird diese offene Potential der embryoid bodies in diese neuronale Richtung eingeschränkt. 

• Expansion/Vermehrung der Nestin-(+)-Zellen in N2-Medium (bFGF => mitogen, SHH, FGF-8)
• Entfernen von bFGF (mitogen) => Zellen proliferieren nicht mehr, sondern  differenzieren sich in vorgegebene Richtung (neuronal, pankreatisch)

 => RT-PCR-Analyse + Immunmarkierung

2 verschiedene Konzepte:

• Erstellung der Embryoid bodies 

=> Selektions-, Expansions- und Differenzierungsphase (wie bei murinen SZ)

Dabei wird Shh/SAG, RA zum Medium zugebeben, um die Differenzierung in Motorneuronen zu gewährleisten. Nach der Differenzierung kann diese Motorneuron durch Zugabe von GDNF, BDNF weiter differenziert werden => Motorneurone bilden damit Axone aus und Axone verlängern sich. 

• Erstellung der neuronalen Rosetten 

=> adhärente Kultur 

Rosettenstruktur taucht bei der embryonalen Entwicklung auf (in vivo) => bei der Reifung von Blastocyt => in Epiblast bildet sich ein Rosettenstruktur in einem Übergangsstadium. 

Eine fremd Stammzelle wird von der Empfängerimmunsystem durch HLAs erkannt und beseitigt, da sie nicht kompartibel ist, wenn das Empfängerimmungsystem nicht suprimmiert (keine ständige Lösung) ist. 

• NK-Zellen erkennen Oberflächenstrukturen und lysieren die Stammzellen. 
• Makrophagen erkennen diese Stammzellen und diese werden phagocytiert. 

1. Möglichkeit: mit den induzieten pluripotenten Stammzellen arbeiten, die von Patient selbst stammen
2. Möglichkeit: ein Derivat generieren, die mit jedem Immunsystem kompatibel ist, unabhängig von der Individualität 

Geneditierung: so modifizieren, dass die bestimmte Erkennungsstrukturen auf Stammzellen nicht mehr vorhanden sind. 

Dafür z.B. deletiert man die Gene für HLA-1 und HLA-2. Sie präsentieren gar nicht diese Kompatibilitätstrukturen an der Oberfläche und damit sind sie für diesen Arm des Immunsystems unsichtbar/nicht-fremd. 

Dabei kann man auch in diesem Genlokus von HLA andere Strukturen (PD-L1, HLA-E, CD47) integrieren, die die Immunzellen abzuhalten => z.B. Makrophagen nicht andocken oder NK-Zellen kein Kontakt aufnehmen können, T-Zellen nicht aktiviert werden. 

• Geneditierung um Immunkompatibilität herzustellen
• Stammzellen als „Drugcarrier“

Die Stammzellen erkennen Tumor durch Tumorsignale, die z.B. durch Tumorzellen abgegeben werden und diese werden über das gesamte Körper verteilt. Wenn irgendwo ein Tumor auftaucht, das Immunsystem wird in diesem Bereich hochgefahren. Auch sowas kann als ein Signal für die Stammzellen dienen.

• Stammzellen, die optogenetisch mit entsprechenden Strukturen (Oberflächen- oder Membranproteine der Zellen) gekoppelt sind

Über Licht können diese Stammzellen aktiviert werden. Sie sind lichtsensitiv und verändern ihre Konformation. Mit sowas kann man über Strahlung die Signalwege an- und ausschalten. 

• CAR-T-Zellen

CAR: Chimeric Antigen Receptor => gentechnologisch veränderte T-Zellen mit synthetischen antigenspezifischen Rezeptoren

Sie werden in Membran integriert und können auf die Targetzellen abgestimmt werden. Sobald diese CAR-Rezeptor angedockt wird, wird die T-Zelle aktiviert und diese aktiviert das Immunsystem weiter. 

• Engineerte Stammzellen, die verschiedene Wachstumsfaktoren exprimieren (z.B. für die Mundheilung)

Def:= mikroskopisch kleine Organe als Modelsysteme

Generierung: 

• Kultivierung der Stammzellen
• Bildung der Embryoid bodies in Suspension 
• Differenzierung wird induziert 
• Diese kleine Gewebstrukturen werden genommen und in Matrigel (aus Maus, wie Bindegewebe) gestellt
• Differenzierung dieser Stammzellen in entsprechende Organrichtung (durch Zusatzstoffe, Signalstoffe zur richtigen Zeit), z.B. Zugabe von Aktin A, um Mesodermderivate zu enthalten 
• Gewebsstruktur wird in einer Spinnerkultur gestellt, welche dafür sorgt, dass die Zellen dauern in Suspension bleiben 
• Enstehung des Organoids

• Qualitative Determinanten

Spezifische Faktoren, die man in Kultur bringt, helfen Pluripotenz beizubehalten oder Differenzierungswege einzuleiten.

specific factor, specific fate 

=> Kreuzantagonismus

• Quantitative Determinanten

Wie viel soll von Faktor/Signalstoff zum Kultur zugegeben werden?

=> Absolute Konzentration der Signalstoffe

=> Relative Konzentrationsänderung der Signalstoffe

• Zeitabhängige Determinanten

=> Window of oppurtinity

=> Signaldynamik: Stimuli in der Zelle können unterschiedlichste Dynamiken aufweisen; Rate und Dauer der Signalaktivierung oder deaktivierung regulieren weitere Zellentwicklung.

• Räumliche Determinanten 

=> Stammzellennische mit fixiertem und ortsgebundemen Signal (definierte Umgebung der SZ): 

Signal durch direkten Zell-Zell-Kontakt mit Support-Zellen

Regulation exogener Signale durch Positionierung der Zellen in lokalen Gradienten löslicher Faktoren

• Wenn ein Transkriptionsfaktor hochgefahren wird, dann wird der andere (antagonistische) inhibiert. 
• So ein Transkriptionsfaktor ist selbstreguliert und fördert seine eigene Expression. 
• Jede von dieser Faktor haben bestimmte Zielgen, die duch Faktor gefördert werden => Inhibierung der antagonistische Faktorgene!
• Wenn Expression des Faktors PU1 gefördert wird, dann werden die Gene von Faktor GATA1 inhibiert. 

GATA-1 bindet an GATA-Lokus im entsprechenden Gen, deren Expression hochgefahren wird. Wenn jetzt PU1 über Hand nimmt (durch die Stimulation der Zelle usw.), dann bindet die PU1 an GATA-1. Diese Bindung verursacht das CBP von Lokus verdrängt wird => CBP sorgt dafür, dass GATA-Lokus transkriptional zugänglich wird. Also PU1 verdränt diese Acetylase CBP, damit wird diese Lokus für die Expression der GATA1 abhängige Gene nicht mehr zugänglich. 

Zugleich wird bei diesem Lokus durch die Anwesenheit von PU1 die Histone methyliert, so dass Ganze transkriptional inaktiv wird. PU1 sorgt dafür, dass die GATA-Zielgene reprimiert werden. 

Beide antagonische Transkriptionsfaktoren sind für die weitere Differenzierung in den einzelnen Zellen in unterschiedlichen Anteilen vorhanden. Wenn jetzt das Ganze in Richtung GATA geht, dann gehts weiter runter zu der nächst stärker differenzierten Stufe, z.B. Eryhtroide Zellen. 

Zelle und die zelluläre Umgebung sind in der Lage aktiv die relativen und absoluten Verhältnisse der Signalstoffen zu verändern. Nach dem LIST-Modell ist die Wahrscheinlichkeit einer Differenzierungsreaktion erhöht, wenn die relevante Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung unter ein kritisches Niveau fällt (Schwellenwert); Andernfalls wird die Selbsterneuerung bevorzugt. 

Zusätzlich zur Identität einer bestimmten Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung, die für die Regulation der Stammzellantworten wichtig ist, können daher die quantitative Natur dieser Wechselwirkung sowie die Dynamik der Rezeptorexpression, -internalisierung und -signalisierung einen signifikanten Einfluss über Entscheidungen über das Schicksal von Stammzellen haben. 

Kontrolle der effektiven Ligand-Rezeptor-Konzentration durch z.B. Internalisierung der Rezeptoren durch Endocytose oder sie können durch Enzyme abgeschnitten werden => nicht mehr stimulierbar. 

:= Zeitfenster, indem es möglich ist, mit diesen unterschiedlichen Reagenzien die Entwicklung/Differenzierung zu beeinflussen.

=> Zeitlich begrenze Phase der Rezeption spezifischer Stimuli, abhängig von Zelltyp und Entwicklungsstadium

=> Nicht in jeder Differenzierungsphase kann man ein Substanz zugeben, der die Differenzierung in eine bestimmte Richtung triggern soll, sondern es gibt ein relativ enges Zeitfenster 

=> von der Reihenfolge der Signalstoffen abhängig,  die man zum Kultur abgibt, kann die Zelle in unterschiedliche Richtungen differenzieren

Bei der Transdifferenzierung kann man eine ausdifferenzierten Zelltyp in eine andere Zelltyp direkt umprogrammieren, ohne wie bei iPS den Weg zurück auf Pluripotenz zu beschreiten und von da aus wieder die Differenzierungsprotokoll durchzuarbeiten.

Ablauf: 

• Fibroblasten werden isoliert und ausplattiert (1 Tag). 
• Dann wurden die Fibroblasten mit Signalstoffen behandelt (18h)

Enzyminhibitoren (5-aza-cytidine), eine DNA-Methyltransferase-Inhibitor, welche in der Lage ist, Methylierung der DNA zu inhibieren und Promotoren zugänglich zu machen, die dazu führen, dass diese Gene wieder epigenetisch neu organisiert werden können. 

• Pankreaslinie wird induziert (Von Fibroblasten zur Pankreaszellen)

Es ist auch möglich den Weg nur halb zurückzugehen => PM Transdifferenzierung; z.B. der Fibroblasten wird kurzfristig Yamanaka-Faktoren zugegeben, das ein Zwischenresultat liefert. Dabei ensteht eine Vorstufe der ausdifferenzierten Zelle. 

Es gibt unterschiedliche Protokolle, die unterschiedliche Faktoren verwenden, um das selbe Ziel zu errecihen, allerdings mit unterschiedliche Effizienz am Ende. 

In-vivo Transdifferenzierung: 

Direkt im Körper werden die Zellen umdifferenziert, ohne Onkogene exprimiert werden oder pluripotente Zellen noch bei Transformation vorhanden sind. 

=> zur Untersuchung und Quantifizierung der Wirkung von Prüfsubstanzen auf Zellen, Gewebe oder Organe in vitro

=> alternative zur Tierversuche 

Vorteile: 

• Durchführung multipler Assays gleichzeitig
• Reduktion oder Ersatz von Tierversuchen
• Untersuchung auf molekularer Ebene (intr a- und interzellulär)
• Reduzierte Kosten
• Verfügbarkeit von Humanmaterial

Anforderungen: 

• Aufschluss über Dosis-Wirkungsbeziehung liefern, z.B. über Dosierungsbereich oder ab wann die Substanzen toxisch wirken usw. 
• Reproduzierbar 
• Geringe Variabilität
• Geringe/keine Toxizität von Assay-Komponenten, so dass sie keinen oder möglichst geringen Einfluss auf das Ergebnis haben 
• Hinweis über Wirkung in vivo (Übertragbarkeit?)

Parameter der Cytotoxizitätstest:

• Zelltyp
• Kulturmethode
• Konzentration der Prüfsubstanz
• Expositionsdauer mit Substanzen und Erholungsphase der Zellen
• Endpunkte => Was misst man? z.B. Zellzahl, Vitalität, Fluoreszenz usw. 
• Aussage => Welche Aussage liefert diese Test, wenn alles optimal konzipiert wird? 

Ablauf:

• Die Zellen heften sich an der Substratoberfläche an. Wenn diese Anheftungsphase abgeschlossen ist, kann man mit den eigentlichen Assay beginnen. 
• Testsubstanz ins Kulturmedium in unterschiedlichen Konzentration zugegeben und inkubiert. Wie lange diese Inkubation dauert, hängt von der Wirksmechanismus der Substanz.
• Nach dieser Expositionsdauer wird Assay durchgeführt, Endpunkt bestimmt oder Fluoreszenz gemessen.
• Nach der Expositionsphase kann man auch eine Erholungsphase anschließen, wird aber oftmals nicht gemacht.
• Dazu muss man aber das Kulturmedium wechseln, so dass alle Wirkstoff im Medium entfernt ist, die nicht von Zellen aufgenommen wurde. Schädigungen können sich auch erst nach der Erholungsphase manifestieren.
• Anschließend wird das Assay ausgelesen.

=> Bestimmung der Anzahl vitaler Zellen in einer Kultur oder einem Gewebe nach dem Exposition mit Wirksubstanz

=> Welche Konzentration kann man anwenden, ohne Schaden zu Zellen zu bringen?

• Nachweis der Membranintegrität 

Exklusionsmethode

LDH-Assay

• Metabolische Assays

Fluoreszenz-Test

Aufnahme von Neutralrot

• Farbstoff => nicht membrangängig (keine Aufnaheme geladener Farbstoffe ab Molekulargewicht > 200)
• z.B. Trypanblau drängt durch die deffekte Membrane und somit färbt die Zellen
• Anteil der blauen Zellen ist ein Ausmaß für so ein Toxizitätassay (Trypanblau wirkt ab bestimmten Konzentration toxisch)

Fluoreszenzfarbstoffe: ebenfalls Exklusionsmethode

• DNA bindend
• nicht toxisch
• nicht membrangängig

Sie kommen durch die Zelle, nur wenn es beschädigt sind und sie interagieren mit DNA, sowie fluoreszieren => Fluoreszenzaufnahme. 

Manchmal auch nicht behandelte Zellen können im Kultur beschädägt sein. Deswegen es ist wichtig eine Kontrolle mit den nicht behandelten Zellen zu machen => um die eigentliche Anzahl an geschädigten Zellen durch das Wirkstoff zu messen.  

• LDH befindet sich normalerweise im Cytoplasma, bei Membranschädigung befindet sich LDH im Kulturüberstand 
• Oxidation/Umwandlung von Lactat zu Pyruvat unter Reduktion von NAD+ zur NADH durch LDH
• Wasserstoff von NADH wird dabei genutzt, um ein chromogene Substanz umzusetzen
• Die Zellschädigung kann man nach der Expositionsphase durch Prüfsubstanz verfassen => z.B. Fluoreszenz 
• nicht-destruktiv, da es eine Messung des Kulturüberstandes stattfindet 

Metabolische Aktivität ist nicht immer identisch mit Vitalität => Verifizierung erforderlich, z.B. Kontrolle im Mikroskop

Es kann z.B. sein, dass die Zellen nicht lethal geschädigt werden, aber bei metabolischen Read-out eine andere Veränderung sichtbar wird, z.B. die Atmungsaktivität der Zellen ist reduziert, sie sterben aber nicht ab. 

Fluoreszenztest: z.B. Calcein-AM

• nicht toxisch
• membrangänglich 

=> Hydrolysierung der membrangängige Komponente durch aktive enzymatische Aktivität (Acetylesterasen), die in der lebenden Zellen vorherrscht, in den toten Zellen aber nicht. Damit wird unterschieden, ob Zellen vital sind oder nicht. 

• Die vitale Zelle fluoresziert in Folge der Hydrolysierung 
• Gegenfärbung der toten Zellen mit nicht membrangängige Fluoreszenzstoffe

z.B. mit Propidium-Iodid => kann nur durch parforierten (toten) Zellen hindurchdiffundieren => lagert sich an DNA und fluoresziert rot. 

MTT-Test: 

Tetrazoliumsalzen + Dehydrogenasen (in aktiven Mitochondrien oder Cytosol der vitalen Zellen) => Formazane, die unterschiedliche Farben haben können (je nach Struktur). 

• Zellzahl einstellen (z.B. 2 verschiedene Zelltypen)
• 1 Tag Vorkultur (Zellen wachsen, adhärieren) 
• 24-36 h Inkubation mit Prüfsubstanzen + ansteigender Konzentration von links nach rechts + Blank (keine Zellen) + Kontrolle (nur organisches Lösungsmittel, die zur Lösung der Substanz benutzt wurde)
• Erholungsphase (optional)
• Zugabe von MTT, 2-3 h
• Zellaufschluss mit SDS/DMSO => Lysat 
• Photometrische Quantifizierung => Wenn viel abgestorbene Zellen vorhanden waren, wurden entsprechend viel weniger MTT umgesetzt.
• Wendepunkt der Kurve (IC50; solideste/stabilste Punkt der Kurve) => spricht für unterschiedliche Konzentration bei verschiedene Zellen => Vergleichen von zwei verschiedene Zellen 

Aufnahme von Neutroalrot: 

• ungeladen, farblos, membrangänglich 

Neutralrot wird in die vitale Zellen aufgenommen und wenn diese Farbstoff in Lysosomen gerät (pH 5), wird sie ionisiert (nicht mehr membrangängig) und bleibt in Lysosom (Ionenfalle). Zellen kann man mikroskopieren oder Farbstoff extrahieren und photometrisch messen. Wenn die Zellen rot sind, dann sind sie vital.

=> Bestimmung der Anzahl sich aktiv teilender Zellen in einer Kultur oder einem Gewebe 

• Immunologische Proliferationstest
• Proteingehalt
• DNA-Synthese 
• Analyse der Zellzyklusphasen

Antikörper gegen Proteine des Zellzyklus, z.B.

• Cycline 

Konzentration von Cyline hängt von den bestimmten Phase des Zellzyklus 

=> nicht immer vorhanden

• Ki67

Diese ist assoziiert mit allen Phasen von Zellzyklus und wenn sich die Zelle nicht mehr in Zellzyklus befindet, dann geht die Konzentration von Ki67 auch runter. 

• PCNA

Die Konzentration von diesen Indikatoren für die Zellzyklus z.B. über ELISA verfasst werden.

=> Messung des Proteingehalts in der Zelle

• Zunahme der Proteingehalt als Indiz für Proliferation
• Bradford-Assay 

Zellzahl einstellen => Prüfsubstanz applizieren/inkubieren => Zellaufschluss mit SDS => Kalibrationskurve mit Proteinstandard 

• Wachstumsinhibition > 30% => toxisch 

=> verfassen die Zunahme der DNA-Menge

Radioaktiv markiertes Thymidin bzw. Uridin wird zugegeben

• Diese Markern bauen sich bei der Replikation in DNA ein
• Zellen werden nach einem Tag werden mit NaOH lysiert
• Quantifizierung der DNA-Menge, die repliziert wurde, im Scintillationszähler

Nicht-radioaktiv: Bromdesoxyuridin BrdU

• kompetiert mit Thymidin bei der Einbau
• Immunchemische Markierung von Bromdesoxyuridin => Nachweis der Integration

Enzym markierte Antikörper gegen Bromdesoxyuridin => Enzym setzt die TMB um => Je mehr von diesen TMB umgesetzt wird, umso mehr wurden die Zellen repliziert => höhere/stärkere Proliferation 

=> Wie viele Zellen befinden sich in unterschiedlichen Zellzyklusphasen?

=> mittels FACS-Gerät 

• Kontrolle (links) & behandelte Probe (rechts)
• 2 Signale, die gemessen wird: DNA-Gehalt mittels DAPI & fluoreszenzmarkierte Bromdesoxyuridin 

=> Subpopulationen (Zellen, die in der verschiedene Phasen der Zellzyklus sich befinden) zuordnen

Es gibt viel mehr Zellen in der G2-Phase bei der Probe als bei der Kontrolle => Zellen bleiben bei der Probe in der G2-Phase aufgrund der behandelten Wirkstoff stecken. 

Problem: Nicht alle Zellen in Kultur sind in den selben Zyklusphase im Beginn der Experiment. Dafür muss man die Zellen synchronisieren, so dass alle in der gleichen Zyklusphase die Experiment beginnen => Synchronisierung