Mikrobiologie

Wenn ein lebenswichtiger Nährstoff des Kulturmediums aufgebraucht ist oder ein Abfallprodukt des Organismus sich im Medium anhäuft und das Wachstum hemmt.

In jedem Fall hört das exponentielle Wachstum auf und die Population erreicht die stationäre Phase.

In der stationären Phase gibt es keine Nettozunahme oder Nettoabnahme in der Zellzahl und somit beträgt die Wachstumsgeschwindigkeit der Population null. Obwohl die Population während der stationären Phase nicht wachsen kann, können viele Zellfunktionen weiterlaufen, darunter der Energiemetabolismus und biosynthetische Vorgänge.

Einige Zellen können sich während der stationären Phase sogar teilen, aber es gibt keine Nettozunahme der Zellzahl. Das liegt daran, dass einige Zellen in der Population wachsen, während andere absterben, die beiden Vorgänge gleichen einander aus. Dieses Phänomen bezeichnet man als kryptisches Wachstum.

Zur Herstellung einer Zehnfachverdünnung (10–1) kann man 0,5 ml einer Probe mit 4,5 ml eines Verdünnungsmittels mischen oder 1,0 ml einer Probe mit 9,0 ml eines Verdünnungsmittels.

Braucht man eine Hundertfachverdünnung (10–2), kann man 0,05 ml mit 4,95 ml eines mischen oder 0,1 ml mit 9,9 ml des Verdünnungsmittels. Alternativ kann man 10–2 Verdünnungen herstellen, indem man zwei Zehnfachverdünnungen in Serie herstellt. Bei dichten Kulturen braucht man serielle Verdünnungen, um zählbarer Kolonien zur Ausplattierung zu erzielen.

Wenn man also z.B. eine Verdünnung von 10^–6 (1/10^6) benötigt, kann man sie durch drei aufeinander folgende 10–2 (1/102) Verdünnungen oder sechs aufeinander folgende 10^–1 Verdünnungen erreichen.

1/10^7

Licht, Wasseraktivität, Sauerstoff, pH, Temperatur, Nährstoffe, osmotische Einflüsse.

Psychrophilie:
• erhöhter Anteil an ungesättigten Fettsäuren mit kürzeren Ketten, um ihre Membran aufrecht zu halten und in der Kälte flexibel (halbflüssig) zu bleiben.
•„Kälteschock»-Proteine und Kryoprotekanzien wirken als Frostschutzproteine, welche die
Bildung von Eiskristallen, die die Cytoplasmamemembran durchlöchern könnten, verhindern.

Thermophilie:
 •Lipide sind reich an gesättigten Fettsäuren, da sie eine stärkere hydrophobe Lebensumgebung ausbilden, was zur Stabilität der Membran bei hohen Temperaturen beiträgt.
• Einige Hyperthermophile Archaea haben in ihren Membranen keine Fettsäuren, sondern C40-Kohlenwasserstoffe (aus Isopren Einheiten). Die ganze Struktur bildet eine Lipidmonoschicht, die viel hitzeresistenter ist.

-> Stabilität und Funktionsfähigkeit/ Transportfähigleit

Wenn ein Organismus in einem Medium mit niedriger Wasseraktivität wächst, kann er nur Wasser aus seiner Umgebung erhalten, indem er seine innere Konzentration gelöster Stoffe erhöht um das Wasser durch Osmose aufzunehmen.

Die kompatiblen, stark wasserlösliche Stoffe (Zucker, Alkohole, Aminosäurederivate) werden entweder synthetisiert oder aus der Lebensumgebung aufgenommen, wobei sie die Aktivität der Makromoleküle innerhalb der Zelle nicht beeinflussen. Die Konzentration der kompatiblen gelösten Stoffe in der Zelle hängt von der Konzentra-
tion in der Lebensumgebung ab.

Sauerstoff: 21%
pH Neutralwert: pH 5.5-7.9
Osmotische Einflüsse: isotonische Lösung (zum Blutplasma isoosmotische Lösung
Licht: genügend (falls phototroph)
Druck: Normaldruck 1 bar
Temperatur: ~37°C (Mesophile)
Wasseraktivität: In den meisten Fällen hat das Cytoplasma einer Zelle eine höhere Konzentration gelöster Stoffe als die Umgebung, so dass Wasser dazu neigt, in die Zelle hinein zu diffundieren (positive Wasserbilanz). Wenn sich eine Zelle jedoch in einer Umgebung befindet, in der die Konzentration gelöster Stoffe die des Cytoplasmas übertrifft, dann fließt das Wasser aus der Zelle und sie dehydriert.

O2 selber nicht giftig ist, aber die toxischen Derivate des Sauerstoffs können Zellen schädigen.

Die Organismen haben Enzyme entwickelt, die diese Verbindungen zerstören. Superoxid und H2O2 sind die am häufigsten vorkommenden Formen toxischen Sauerstoffs, also kommen Enzyme, die diese Verbindungen zerstören, häufig vor. Alle aeroben oder aerotoleranten Zellen müssen zur Entgiftung reaktiver Sauerstoffverbindungen die Enzyme Superoxiddis-
mutase und entweder Katalase oder Peroxidase haben.

Die DNA ist Träger des Erbgutes. Auf ihr wird die genetische Information gespeichert und an die Nächste Generation von Zellen weitergegeben.

Sie dient als Vorlage für die Transkription (die RNASynthese) und darauffolgende Tranlsation (Proteinsynthese). Sie liegt meist als Doppelhelix vor, welche aus zwei komplementären Strängen aufgebaut ist.

Die Einzelstränge sind Oligonukleotide, also ein Polymer von Nukleotiden, welche über Phosphodiesterbindungen verbunden sind. Sie bestehen aus einem Zucker-Phosphat-Rückgrat und den Nukleobasen. Die Basensequenz bezeichnet man als Primärstruktur der DNA. Es gibt 4 Nukleobasen, welche in der DNA vorkommen, zwei Purine (Adenin und Guanin) und zwei Pyrimidine (Cytosin und Thymin).

Der DNA-Doppelstrang wird aus zwei komplementären, antiparallel (einer 3’-5’, der andere 5’-3’) Einzelsträngen aufgebaut. Durch spezifische Wasserstoffbrücken zwischen je einer Pyrimidin und einer Purin Nukleobase wird der DNA-Doppelstrang aufgebaut.

Cytosin (C) paart mit Guanin (G)
Thymin (T) paart mit Adenin (A)

Da bei der GC Paarung eine Wasserstoffbrücke mehr ausgebildet wird, ist sie stabiler als die AT Paarung. Es gibt verschiedene Sekundärstrukturen, in welcher die DNA-Doppelhelix vorliegen kann. Am häufigsten ist die B-Form. Die spezifische Anordnung der beiden Stränge führt dazu, dass die Helix eine grosse und eine kleine Furche aufweist. In der grossen Furche sind gewisse Teile aller
Nukleobasen exponiert. Dies erlaubt es Proteinen sequenzspezifisch an die DNA zu binden.

Die meisten DNA-Bindeproteine haben eine Erkennungshelix (α-Helix, Sekundärstruktur von Proteinen), welche sequenzspezifisch in die grosse Furche der DNA-Doppelhelix binden kann.

DNA-Bindeproteine sind oft Homodimere (ein Proteindimer, welches aus zwei identischen Monomeren aufgebaut ist), welche umgekehrte Wiederholungs-sequenzen binden können. Beide Monomere enthalten je eine Erkennungshelix, welche wiederum eine der beiden Wiederholungssequenzen
binden kann.

Die DNA wird durch Überspiralisierung in eine «Struktur höherer Ordnung» überführt. Diese Überspiralisierung wird von Topoisomerasen katalysiert. DNA-Gyrasen (Typ II Topoisomerasen) sind Enzyme, welche den DNA-Doppelstrang schneiden und ihn einmal um sich selbst drehen. Dies führt zu einer negativen Überspiralisierung der DNA und somit zu einer Spannung im Molekül. Um diese Spannung entgegenzuwirken verdreht sich die DNA um sich selbst (Supercoil).

Das Replisom ist ein Replikationskomplex, welcher folgende Schlüsselreplikationsproteine enthält:

• DNA-Gyrase: hebt die Überspiralisierung auf (vor der Replikationsgabel)
• DNA-Helikase: entwindet die DNA (Einzelstrangbildung) (führt zur Überspiralisierung vor der Gabel)
• DNA-Primase: bildet die RNA-Primer, welche als Startpunkt für die Synthese der neun DNAStränge dienen
• DNA-Polymerase III: synthetisiert die neuen DNA-Stränge, der Matrizenstrang dient jeweils als Vorlage. (Der Leitstrang wird in der Richtung synthetisiert, in welcher sich das Replisom bewegt, der Folgestrang wird in die entgegengesetzte Richtung synthetisiert, was zur Bildung von Okazaki Fragmenten führt)
• Tau: ist wichtig für die Interaktion von Polymerase und Helikase

Dazu dient der Promotor, eine Sequenz auf der DNA, welche von der RNA-Polymerase erkannt wird und somit Ausgangspunkt der Transkription ist.
Der Sigmafaktor erkennt und bindet an Promotorsequenzen und rekrutiert RNA-Polymerase.

Ribosomale RNA (rRNA): RNA-Moleküle, welche Bestandteil des Ribosoms sind. Zum Beispiel die 16S rRNA bindet an die Shine-Dalgarno-Sequenz der mRNA und hilft so den Ort des Translationsbeginns zu erkennen.

Transfer RNA (tRNA): Eine RNA mit ausgeprägter Sekundärstruktur. Auf der einen Seite enthält sie eine Sequenz von drei exponierten Nukleotiden (Anticodon), welche mit jeweils drei Nukleotiden der mRNA (Codon) interagieren können. Am 3’-Ende der tRNA ist dann jeweils die entsprechende Aminosäure über eine Esterbindung gebunden.

Messenger RNA (mRNA): Dient als Vorlage für die Translation. Jeweils drei Nukleotide (Codon)
auf der mRNA codieren für eine Aminosäure

Zuerst muss der Startcodon gefunden werden (AUG). Dann wird immer ein Codon nach dem anderen abgelesen und si die entsprechende Aminosäure ins entstehende Polypeptid eingebaut.

Als zentrales Dogma der Molekularbiologie bezeichnet man den INformationsfluss von der DNA über die RNA zum Protein.

Archaea und Eukarya haben grosse Ähnlichkeiten hinsichtlich der Molekularbiologie der Zelle, (DNA-, RNA-, Proteinsynthese). Anderseits haben die Bacteria und Archaea grosse Ähnlichkeiten in der mikroskopischen Zellstruktur sowie im Stoffwechsel.

• Ähnliche, aus mehreren Proteinuntereinheiten zusammengesetzte RNA-Polymerase II
• mehrere Initiations- und Elongationsfaktoren bei der Translation (Ribosome ähneln aber den der Eukarya)
• Beginn der Transkription wird durch die TATA-Box markiert - Gegen Zellwand Antibiotika Resistenz - Werden durch das Diptherie Toxin gehemmt 
• archaelle Introns
• Histone zur Verpackung der DNA
• Mehrere Replikationsorigins und ähnliche Origin-Erkennungskomplexe
• Das erste Methionin bei der Translation ist nicht modifiziert

Durch das Spleissen werden die Introns, die nichtkodierenden Regionen auf der DNA, entfernt und die Exons, die kodierenden Sequenzen, miteinander verbunden um die fertige mRNA und das darauffolgende funktionsfähige Protein zu erzeugen. Durch alternatives Spleissen können aus derselben DNA-Sequenz verschiedene mRNA-Moleküle erzeugt werden und dadurch eine grosse Proteinvielfalt mit unterschiedlichen Eigenschaften und Funktionen geschaffen werden. Also kurz: Ein Gen kann unterschiedliche Proteine kodieren.

• Archaellen Introns werden von spezifischen Endoribonucleasen ausgeschnitten, die die Exon -Intron-Verbindungsstellen erkennen (sie ist homolog zwei Untereinheiten des Enzymkomplexes, der Introns aus der eukaryotischen tRNA im Zellkern entfernt).
• Das RNA-Spleißen findet im Zellkern statt. Der Vorgang des Spleißens wird von einem großen makromolekularen Komplex, dem Spleissosom katalysiert. Dieser entfernt die Introns, durch erkennen konservierter Sequenzen auf den Spleiß-Verbindungsstellen, und verbindet die nebeneinander liegende Exons, wodurch die endgültige mRNA gebil-

det wird.

Nicht nur durch Überspiralisierung sondern die negativ geladene DNA wird um positiv geladene Histone gewickelt welche die Nucleosome ergeben, die wiederrum das vollständige Chromatin bilden, welches stark oder weniger stark verdichtet (kondensiert) wird. Während der Zellteilung muss die DNA kondensieren, damit sie sich gleichmässig auf die neuen Zellen verteilen kann (Schutz der Chromosomintegrität). Durch die Verpackung wird auch die Zugänglichkeit für die Ge-
nexpression reguliert.

Linearen Chromosomen würden nach jeder Replikationsrunde kürzer werden, da die DNA-Polymerasen immer eine RNA-Primer für die Initiation brauchen. Diese werden später abgebaut und hinterlassen eine Lücke. Eukaryoten haben dieses Problem mithilfe der Telomerase gelöst. Die Enden der Chromosomen, Telomere genannt, enthalten repetitive DNA-Sequenzen, welche von der Telomerase am 3’-Ende des Leitstrang/Führungsstrang erkannt werden. Dieses Enzym ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, welche die Transkription in umgekehrter Richtung katalysieren kann (RNA→DNA). Das Enzym selbst enthält eine kleine RNA-Matrize als Cofaktor für die Initiation der DNA- Synthese. Die Telomerase geht nach einem Wiederholungsprinzip vor, um den Führungsstrang um ein Vielfaches zu verlängern. Wenn diese Verlängerung abgeschlossen ist, kann der andere Strang (der Folgestrang) durch die Primase mit einem RNA-Primer vorbereitet werden und die DNA auf ganz
normale Weise von der DNA-Polymerase repliziert und von der Ligase vervollständigt werden.

Erkennung des ersten AUG (Startcodon) auf der mRNA.

Bei den Prokaryoten wird das AUG verwendet, welches nach einer Shine-Dalgarno-Sequenz lokalisiert ist.

• Während der Transkription wird der unreifen mRNA methylierte Guaninnucleotide am 5’-Phosphatende angefügt. Dieser Vorgang wird als Capping bezeichnet. Das Guanosin-Cap wird für die Translation benötigt und fördert mit Hilfe spezifischer Cap-Bindeproteine die Bildung des Inititationskomplexes zwischen der mRNA und dem Ribosom.
• Im zweiten Prozessierungsschritt, nach der Transkription, wird das 3′-Ende des primären Transkripts zurückgeschnitten und 100 – 200 Adenylatreste als Poly(A)Schwanz angefügt. Die Schwanzerkennungssequenz, AAUAAA, liegt nahe dem 3′-Ende des primären Transkripts und hinter dem Stoppcodon des Proteins, das von der mRNA kodiert wird. (Somit wird der Poly(A)-Schwanz nicht translatiert). Der Poly(A)-Schwanz stabilisiert die mRNA und muss entfernt werden, bevor die mRNA abgebaut wird. Der Poly(A)Schwanz wird außerdem für die Translation benötigt.
• Erst im dritten Schritt wird die mRNA gespleisst.

Transkription

• Negative Kontrolle der Transkription - Mechanismus der Regression
• Negative Kontrolle der Transkription - Mechanismus der Induktion
• Die positive Kontrolle der transkription

Translation

• Attenuation
• Riboswitch
• Antisense RNA

Posttranslation

Der Repressor (DNA-Bindeprotein) kann zwei Konformationen annehmen, die Konformationsänderung wird durch Binden des Corepressors ausgelöst. Der Repressor/Corepressor Komplex kann an eine spezifische DNA-Sequenz (Operator) stromabwärts vom Promotor binden. Das Binden und Weiterlaufen der RNA-Polymerase werden blockiert (keine Transkription)

Der Repressor kann die spezifische DNA-Sequenz (Operator) stromabwärts vom Promotor binden. Das Binden und Weiterlaufen der RNA-Polymerase werden blockiert (keine Transkription). Binden des Induktors führt zu einer Konformationsänderung, der Repressor/Induktor Komplex kann den Operator nicht binden und fällt ab – die Genexpression wird induziert.
 

Regulatorisches Protein wirkt als Aktivator der Transkription. Aktivatorprotein kann an die Aktivator-bindestelle binden, wenn es den Induktor gebunden hat. RNA-Polymerase wird mobilisiert sobald der Aktivatorprotein/Induktor Komplex an die Akti-
vatorbindestelle gebunden ha

Kontrolle die zur vorzeitigen Termination der Transkription führt. Die Synthese von Aminosäuren steht oft unter der Kontrolle mehrerer Mechanismen, einer davon ist die Attenuation. Ein Leaderpeptid wird am Beginn des Operons transkribiert. Die Aminosäure, für wesen Biosynthese das Operon kodiert, ist mehrfach im Leaderpeptid enthalten. Wenn kein Aminosäuremangel vorliegt, kann das Leaderpeptid translatiert werden, was zur Bildung einer Sekundärstruktur führt, welche zum Abbruch der Transkription führt, bevor die eigentlichen Strukturgene auf mRNA umgeschrieben wurden. Wenn ein Aminosäuremangel vorliegt, bleibt das Ribosom bei den Codons der fehlenden Aminosäuren stehen, was die Bildung einer alternativen Sekundärstruktur führt, welche es der RNA-Polymerase erlaubt, die Transkription zu beenden. Dieser Mechanismus kann nur funktionieren, da die Transkription und Translation gleichzeitig ablaufen.

RNA kann kleine Moleküle erkennen und spezifisch Binden (katalytisch aktiv => Riobzyme, regulatorisch aktiv => Riboswitches). Riboswitches benötigen keine regulatorischen Proteine. Durch Bindung eines Metaboliten verändert sich die Sekundärstruktur der mRNA (Shine-Dalgarno Sequenz wird in Stammschleifenstruktur involviert), was zur Folge hat, dass das Ribosom nicht mehr binden kann. Die Translation ist gehemmt. Riboswitches könnten Überreste aus der RNA-Welt sein.
 

Antisense RNA: sRNA (auch Antisense RNA) besitzt eine Basensequenz komplementär zur kodieren-den Sinnsequenz. Translation wird durch Bildung Doppelsträngiger RNA gehemmt. Doppelsträngige RNA wird durch Ribonucleasen abgebaut. «Anti-Gen» kodiert für Antisense RNA. Transkription von Anti-Genen nur unter Bedingungen wo die Expression des Ziel-Gens unterdrückt wer-
den soll.

Phosphorylierung (nicht thematisiert)

Abbau (nicht thematisiert)

Rückkopplungshemmung

Die meisten DNA-Bindeproteine haben eine Erkennungshelix (α-Helix, Sekundärstruktur von Proteinen), welche sequenzspezifisch in die grosse Furche der DNA-Doppelhelix binden kann. DNABindeproteine sind oft Homodimere (ein Proteindimer, welches aus zwei identischen Monomeren aufgebaut ist), welche umgekehrte Wiederholungs-sequenzen binden können. Beide Monomere enthalten je eine Erkennungshelix, welche wiederum eine der beiden Wiederholungssequenzen binden kann. Zwischen der DNA und dem Bindeprotein werden vor allem Wasserstoffbrücken und van der Waals Interaktionen ausgebildet.

Bei der positiven Kontrolle der Transkription kann die Transkription nur stattfinden, wenn ein Aktivatorprotein an den Operator bindet. Bei der negativen Kontrolle wird hingegen durch das Binden
eines Repressors die Transkription verhindert.

Katabolitrepression hängt im Allgemeinen von einem Aktivatorprotein (positive Kontrolle) und einem Repressor (negative Kontrolle - Induktion) ab. Das zyklischen AMP-Rezeptor Protein (CRP) bildet ein Dimer, wenn es cAMP gebunden hat und kann spezifische DNA-Sequenzen binden. Glucose hemmt die cAMP Synthese und fördert dessen Transport aus der Zelle. Wenn die Glucose aufgebraucht ist, steigt die cAMP Konzentration, CRP dimerisiert, bindet an die Aktivatorbindestelle und unterstützt das Binden der RNA-Polymerase. Wenn die Laktose Konzentration hoch ist, bindet diese an den Lac-Repressor und inaktiviert ihn. Der Repressor fällt vom Operator ab und die Tran-
skription kann stattfinden.

Ein Zwei-Komponenten-Regulationssystem dient dazu, Signale aus dem Lebensraum (Osmotischer Druck, Sauerstoffkonzentrationen, Mangel an organischem Stickstoff) aufzunehmen und and spezifische Zielorte weiterzuleiten. Es besteht aus einem Sensor-Kinasen-Protein (Transmembranprotein) und einem Responseregulatorprotein (cytoplasmatisches Protein). Die Sensorkinase kann ein Signal aus der Umgebung aufnehmen und gibt es an das Responseregulatorprotein weiter (Signaltransduktion). Die Signaltransduktion geschieht durch den Übertrag einer Phosphatgruppe von der Kinase auf das Regulatorprotein. Die Phosphorylierung des Regulators ändert dessen Affinität zum Operator. Eine Rückkoppelungsschleife stellt das System wieder auf null (Phoshpatase, welche den
Regulator wieder dephosphoryliert).