Molekularbio

Protein Faktoren werden von der Polymerase zu den Signalen gebracht. Zuerst wird die prä-mRNA geschnitten und das 3' Ende bekommt eine polyAdenylierung. Die Polymerase Dissoziert oder synthetisiert weitere RNA. 

Alternativlösung (je nachdem wie man die Frage versteht):

In Eukaryonten werden die meisten RNAs nach der Synthese durch Prozessierungschritte modifiziert (5‘ capping, splicing, 3‘ Polyadenylierung)
3’Ende: Polyadenylierung: post-transkriptionale Modifikation: Anhängen von A- Nukleotiden an das 3’Ende der prä-mRNA, dient zur Erhöhung der Stabilität und Translatierbarkeit und zum Schutz der mRNA vor Abbau durch 3’-Exonucleasen

5’Ende: Capping: post- (eigentlich co-)transkriptionelle Modifikation: modifiziertes G- Nukleotid, welches an 5’Ende geknüpft wird, erhöht Stabilität und ist wichtig für den Transport der RNA aus dem Kern ins Zytoplasma. 

mRNA (messenger-RNA):produziert durch mRNA durch RNA Pol II, codiert für Proteine tRNA (transfer-RNA): produziert durch RNA Pol III, vermittelt bei Translation richtige Aminosäure zu richtigem Codon auf der mRNA
rRNA (ribosomal-RNA): produziert durch RNA Pol I, Bestandteil von Ribosom

siRNA (small interfering-RNA): produziert durch RNA Pol IV, Bedeutung bei RNAi 

positive Kontrolle: Grundzustand ist „AUS“. Kontrolle bewirkt Anschalten der Transkription --> Aktivator verbessert die Bindung und Transkriptionsinitiation der RNA Polymerase an einem schwachen Promoter. 
negative Kontrolle: Grundzustand ist „AN“. Kontrolle bewirkt Abschalten der Expression. --> Respressor verringert die Bindung und Transkriptionsinitiation der RNA Polymerase an einem Promoter

Repression: Trp bindet an einen Repressor, wodurch dessen Struktur sich ändert und er an die DNA binden kann=>keine Synthese mehr (negative Kontrolle)
Trp: cis-aktiver Operator mit Bindungsstelle für Repressor (ist Tryptophan da, wird die Transkription gestoppt) Operon wird von Endprodukt reprimiert. 

wenn keine Lactose vorhanden: Repressor bindet an Operator, =>keine Synthese
wenn Lactose vorhanden: Lactose bindet an Repressor, der dadurch nicht an Operator binden kann=>Synthese von Proteinen (die z.B. Lactose abbauen) (positive Kontrolle) negative Regulation weil wenn etwas an die DNA bindet lauft nix mehr
Das lac-Operon wird sowohl negativ durch einen Repressor, als auch positiv durch einen Aktivator reguliert. 

Anwesenheit von Lactose: Repressort bindet Lactose, Reduktion der Bindung am Operator --> RNA Synthese möglich. Synthese läuft nur bei wirklichem Mangel: cAMP bindet an CAP --> Komplex bindet an DNA und stimuliert die Transkription
Anwesenheit von Lactose und Glucose:
Glucoseverwertung ist effizienter, als Lactoseverwertung. Anwesenheit von Glucose führt zu niedrigen cAMP Konzentrationen. CAP (grün) bindet lac Operon nicht => Katabolitrepression
kaum Bindung von Lac an Operator, kaum RNA-Synthese, kaum Proteinsynthese 

Promoter – 5’UTR – kodierender Bereich – 3’UTR – Terminator –Enhancer

Promoter: DNA-Abschnitt am 5’-Ende, reguliert Expression des Gens durch Bindung von allg. und spez. Transkriptionsfaktoren (mit deren Hilfe z.B. die RNA Polymerase bindet)

kodierender Bereich: = Exon: DNA-Sequenz die fürs Protein codiert, wird in mRNA umgewandelt 

Terminator: hier hört die Transkription auf

Enhancer: Bei der Bindung eines Aktivatorproteins erleichtert ein Enhancer die Anlagerung des Transktiptionskomplexes

UTR: = Intron: DNA-Sequenzen vor und nach der kodierenden DNA, werden transkribiert, aber nicht translatiert (für Stabilität von mRNA, Regulation von Translationsinitiation und Translationsgeschwindigkeit) 

Beides sind Kontrollelemente
cis-aktiver Faktor: wirkt nur auf ein direkt damit assoziiertes Gen, z.B. DNA-Sequenzen, die regulatorische Proteine binden (Operatoren, Enhancer)
trans-aktiver Faktor: wirkt auf verschiedene unabhängige Gene, z.B. regulatorische Proteine (Aktivatoren, Repressoren, Koaktivatoren, Korepressoren) 

Es werden nicht zu jeder Zeit alle Proteine benötigt. Durch die Regulation wird die Verschwendung von Ressourcen und Energie in der Zelle verhindert. Es ist effizienter nur die Proteine zu bilden, die gebraucht werden. Zudem ist die Zelle schnell reaktionsfähig auf Umweltveränderungen. 

Es erfolgt eine überproportional verstärkte Transkription, wenn mehrere Transkriptionsfaktoren (wie Aktivatoren) an einen Promoter binden, da sich die Faktoren gegenseitig verstärken. 

Ein Operon ist eine Funktionseinheit der prokaryotischen DNA. Es besteht aus einem Operator, einem Promoter und aus Genen, die für Proteine codieren (ORFs). 

Sie Expression eines katabolischen Enzyms (baut komplexe Moleküle ab für Energiegewinnung und Entgiftung des Organismus) wird gehemmt, solange eine bessere Energieressource vorhanden ist.
Beispiel: Glucoseverwertung effizienter als Lactoseverwertung

Anwesenheit von Glucose führt zu niedrigen cAMP Konzentrationen CAP bindet lac Operon nicht => Katabolitrepression 

Bei der Regulation der Transkription wirken transaktive Elemente, wie Repressoren, inhibierend auf die Transkription. Die Repressoren binden dabei an die DNA und inhibieren die Transkription auf kürzere, oder längere Distanz. 

Transkriptionsfaktoren können Gene regulieren. Kombiniert man Transkriptionsfaktoren, können sie je mehr Gene regulieren. So kann man aus einer begrenzten Anzahl Transkriptionsfaktoren eine große Vielfalt an Kontrollmöglichkeiten erreichen. Sie binden häufig als Dimere. (Aus zwei verschiedenen T. gibt es sechs mögliche Dimere.) (Bsp.: ABC-Modell der Blütenbildung) 

Northern Blot :

•  Isolation & Denaturierung der RNA-Moleküle (Sekundärstrukturen) - Auftrennung mittels Gelelektrophorese
•  Übertragung des Trennmusters auf Membran (Blotting)
•  Zugabe von markierter Gensonde (von der man das Transkript nachweisen will)->hybridisiert mit der RNA
•  Detektion der hybridisierten RNA nach Waschvorgang 

In-Situ Hybridisierung : 

Gewebeschnitte so aufbereitet, dass die RNA des Gewebes als Hybridisierungs-Target zugänglich werden. DNA-Strang wird mit einem komplementären, radioaktiv markierten Strang hybridisiert, wodurch die DNA-Abschnitte sichtbar gemacht werden. (Detektion des Expressionsorts dank Hybridisierung) 

RT-PCR:

=>Idee: intronfreie DNA isolieren
- Umschreiben der RNA in cDNA mittels Reverse Transkriptase - Vervielfältigung der cDNA mittels PCR
- Auftrennung mittels Gelelektrophorese
- Detektion durch Hybridisierung mit Gensonden
(cDNA mit DNA vergleichen und Position der Introns feststellen) 

Microarrays: 

=>Ziel: Expressionsmuster aller Gene eines Org. gleichzeitig untersuchen und vergleichen
- Herstellung des Trägerelements mit passenden DNA-Sonden (Microarray), d.h. cDNA-Proben auf Microarray geben, jede Probe entspricht dabei einem Gen

- Zugabe der zu untersuchenden RNA, hybridisiert dann mit der cDNA - Waschvorgang
- Analyse der Hybridisierungssignale (z.B. Fluoreszenz) an bestimmten Stellen. Hierbei handelt es sich um visuelle Vergleiche mit grünem und rotem Farbstoff zur Betrachtung der Stärke der Genaktivität 

Reportergene 

- Integration eines Reportergens hinter zu untersuchendem Gen

- Gen und Reportergen unter Kontrolle desselben Promoters
- Aktivität des Reportergens mit Farb- oder Lichtreaktion quantifizieren - Expressionsaktivität des Gens korreliert mit Aktivität de Reportergens 

Promoter :Liegt vor dem RNA-codierenden Bereich Wechselwirkung mit an DNA bindende Proteine, welche den Start der Transkription des Gens signalisieren ermöglicht regulierte Expression des Gens 

40S ribosomale Untereinheit: Kleine Untereinheit der Eukaryonten (UE werden nach ihrem Sedimentationsverhalten benannt)  Aus euk. 80S Ribosomen bilden sich 40S und 60S ribos. Untereinheiten. Die 40S Untereinheit besitzt die Bindungsstellen A, P und E. mRNA und Initiationsfaktoren binden bei der Initiation der Translation an sie. 

Polycistronische rRNA:mRNA, welche durch mehrere hinter einander liegende Gene auf der DNA codiert wird und mehrere ORFs (offene Leserahmen) enthält. 

Transaktiver Regulationsfaktor: Trans-Elemente können auf verschiedene Gene wirken 

Histoncode: Bezeichnet den Informationsgehalt, den die Modifikationsmuster von Histon-Proteinen bestimmen. 

Polyadenylierung: Posttranskriptionale Modifikation der euk. prä-mRNA, Anhängen des Poly-A-Schwanzes an das 3’-Ende der mRNA (Poly-A-Schwanz verkürzt sich mit der Zeit) 

Polyadenylierungssignal: 5’...AAUAAA...3’ 

RNA Polymerase II : Katalysiert die Synthese der RNA bei der Transkription der DNA in Eukaryoten 

Splicing: Teil der Prozessierung von prä-mRNA zu mRNA; Introns werden entfernt und Exons werden verknüpft. 

Stopcodon: UAG, UAA, UGA; Basentrippletts welche den Abbruch/das Ende der Translation zur Folge haben. 

tRNA: transfer-RNA:Vermittelt bei der Translation die richtige Aminosäure zum passenden Codon auf der mRNA      

=>Technik zur Messung der Transkription
Mit Hilfe von Reportergenen kann man die Aktivität von Genexpressionssignalen visualisieren. DNA mit funktionalen Kontroll-Signalen wird mit DNA verbunden, welche für ein leicht nachweisbares Protein kodiert. Die verwendete DNA codiert für Enzyme, deren Aktivität man in einer Farb-oder Lichtreaktion nachweisen kann, die also Auskunft über spezifische Expressionsaktivitäten der Kontrollsignale geben. Ein Reportergen ist Promoterabhängig und ist dort nachweisbar, wo der Promoter aktiv ist. Beispiel:

• GFP (green fluorescent protein): fluoresziert bei der Anregung mit blauem Licht und macht somit andere Proteine sichtbar.
• Beta-Glucuronidase: stellt nach Zugabe eines künstlichen Farbstoffs selber einen Farbstoff her.
• Luciferase: Der Zweck ist also die Sichtbarmachung der Genexpression anderer Gene. 

Das Antibiotikaresistenzgen wird als Transformationsmarker in die DNA transformierter Zellen eingeschleust und erlaubt somit der transformierten Zelle in einem Milieu zu überleben, in welchem „normale“ Zellen sterben würden. So kann man die transformierten Zellen selektionieren. Man kann die transformierten Zellen nur vermehren, wenn man sie zuvor selektioniert hat, denn die transformierte DNA wird nur in wenige der verfügbaren Zellen eingeschleust. (den Rest muss man loswerden) 

Kurz: Ein DNA-Chip, oder Microarray ist ein Trägerelement mit DNA-Sonden für den Nachweis von Nukleinsäuren und beruht auf dem Prinzip der Hybridisierung.
Microarrays werden verwendet, um bekannte Gene zu identifizieren und deren Aktivität zu messen, sie bestimmen also die relative Änderung der Genexpression.

Die einzelnen Felder des Microarrays sind mit einzelsträngigen DNA-Stücken besetzt. Die mit rotem und
grünem Fluoreszenzfarbstoff markierten mRNA aus der Testprobe können bei komplementärer Basenabfolge an die DNA auf dem Chip binden.

Die Position, Wellenlänge und Intensität der entstehenden Mischfarbe wird mit einer Laserkamera detektiert, was Informationen über Unterschiede in der Expression der Gene zwischen verschiedenen Proben liefert. Anwendung in Forschung und Medizin:

• Entwicklung von Biomarkern
• Genomtypisierung: Bestimmung von Arten und Individuen
• Screening für bestimmte Krankheitsanfälligkeiten
• (Medikamentenentwicklung und –Sicherheit, Exposition und Reaktion auf Medikamente und Umweltgifte)
• Klassifizierung von...Tumortypen, antibakterielle Substanzen
• Diagnostik: Zeitgewinn in der klinischen Mikrobiologie
• Analyse der Wirkungsprinzipien von Medikamenten und Umweltgiften 

1) Capping: Am 5’Ende der RNA, cotranskriptionell eine modifizierte Form des Guonasins durch das Capping-Enzym angehängt.

• RNA-Stabilisierung
• Struktur dient als Signal zur Bindung der kleinen ribosomalen UE zu Beginn der Translation

2) Polyadenylierung: PolyA-Komplex erkennt PolyA-Signal auf mRNA. Die prä-mRNA wird geschnitten, die PolyA-Polymerasen verlängern das 3’Ende mit 100- 200 Adenosin-Resten.

• RNA-Stabilisierung
• unterstützt Export der fertigen mRNA ins Zytoplasma

3) Splicing: Introns werden aus der prä-mRNA herausgeschnitten, Exons bleiben übrig. Der Vorgang wird durch Spliceosome katalysiert und ist eine Transesterifizierung. Es gibt auch autokatalytisches Splicing, d.h. ohne Spliceosome, alternatives Splicing und trans-Splicing.

• Codierende Gene bleiben übrig. Je nachdem wie geschnitten wird, bleiben jene codierende Regionen übrig, die man exprimiert haben möchte. 

Dank alternativem Splicing können aus einer prä-mRNA mehrere mRNAs gemacht werden durch Entfernung von Exons (Exon Skipping), Beibehalten von Introns (Intron Retention), oder durch Benützung alternativer Splicestellen (Splice Site Alteration). So kann aus einer prä-mRNA eine große Anzahl an mRNAs und Proteine erzeugt werden. 

Wenn aus verschiedenen prä-mRNAs eine mRNA gemacht wird. (hauptsächlich in Chloroplasten und Mitochondrien) 

CAP
5’UTR
ORF (Protein-kodierende Region) 3’UTR
PolyA Region 

Mechanismus:

• Polyadenylierungs-Komplex erkennt Poly(A)-Signal auf prä-RNA
• Endonukleasen schneiden mRNA
• 100 bis 250 Adenosin Reste werden von der poly(A)-Polymerase darangehängt
• poly(A) binding Protein stabilisiert und beschleunigt

Prokaryoten: Polyadenylierung als Signal für den Abbau von mRNA
Eukaryoten: Schutz der präRNA vor Abbau durch 3'Exonucleasen, Unterstützt Export der fertigen mRNA ins Cytoplasma, Stimuliert Translation

Weitere RNA-Prozessierungsschritte: Splicing, Capping 

Sie tragen keine Information zur Herstellung eines Proteins, aber sie haben eine regulatorische Funktion für die

• RNA-Stabilität,
• Translationsinitiation
• Translationsgeschwindigkeit. 

Die Translation (Erzeugung eines Proteins durch Ablesen der mRNA) findet im Zytoplasma statt. Daran beteiligt sind:

tRNA

• stellt Aminosäuren bereit, enthält ein Anticodon spezifisch für die Codons der mRNA
• codierende Aminosäure jeweils am 3’Ende
• kleeblattförmige Sekundärstruktur, es gibt 2 tRNAs die Methionin tragen (eine nur für die Initiation der Translation, eine für die wachsende Peptidkette)

Ribosomen

• bestehen aus einer großen und einer kleinen Untereinheit, die aus rRNAs und Proteinen bestehen
• Ribosomen und UEs werden nach ihrem Sedimentationsverhalten aufgeteilt

Weiterhin benötigt werden:

• zu translatierende mRNA 
• Aminosäuren 

A) Initiation: Zusammensetzung der Translationsmaschinerie am Startkodon

• (Scanning) kleine ribosomale Untereinheit (UE) bindet am 5'-Cap und wandert entlang der RNA bis zu einem Startkodon
• Grosse UE bindet und die Translation kann beginnen

B) Termination: Erreichen eines Stopcodons

• Release-Faktoren (RF) werden in den ribosomalen Kontext aufgenommen
• Unter Hydrolyse von GTP wird die Aminosäure von der tRNA in der P-Stelle des Ribosoms abgelöst
• Freisetzung der Peptidkette und Trennen der UE des Ribosoms

Das Startcodon ist immer AUG (für Methionin).
Es existieren zwei verschiedene tRNAs, welche das Methionin tragen. Das eine ist speziell für den Start der Translation (dieser bindet an den Komplex aus mRNA und der kleinen UE, danach bindet die große UE). Der andere ist für den Einbau von Methionin in die wachsende Polypeptidkette.
Schritte der Translation-Elongation:

• Codonerkennung

• Peptidbindung

• Translokation

tRNA mit Aminosäure bindet mit dem Antikodon an A-Stelle Peptidbindung zw. den Aminosäuren an der A- und P-Stelle tRNA bewegt sich um ein Triplet auf der mRNA Richtung 3’Ende, verlässt Ribosom an der E-Stelle

Der erste und der dritte Schritt sind dabei energieabhängig. Prokaryoten: fMet-tRNAi (Initiation), Met-tRNA (Elongation) Eukaryoten: Met-tRNAi (Initiation), Met-tRNA (Elongation) 

• Position A: Aminoacyl- oder Erkennungsstelle
  o tRNA bindet durch Interaktion von Antikodon (tRNA) und Kodon (mRNA)

• Position P: Peptidyl- oder Bindungsstelle
  o neue Aminosäure wird mit der wachsenden Peptidkette verknüpft

• Position E: Exitstelle
  o entladene tRNA verlässt das Ribosom 

1. Ein Kodon ist ein Basentriplett, also eine Abfolge von drei Nucleotiden. Immer drei Nucleotide (also ein Codon, oder Triplett) steht für eine Aminosäure (von möglichen 20), oder für ein Start- oder Stopp-Signal. Es können mehrere Codons für die gleiche Aminosäure codieren. Insgesamt gibt es 64 mögliche Basentriplets aus den Nukleinsäuren A, T, G und C. 

Durch die Sekundärstruktur, vor allem Loops und doppelsträngige Bereiche, kann die Menge an Protein, die von einem mRNA-Molekül hergestellt wird, reguliert werden. Faktoren, die beeinflusst werden sind:

• Zugänglichkeit der mRNA für Translationskomplexe
• Ablauf des Scannings
• Bildung interner Bindungssignale (zusätzliche ORFs der mRNA können translatiert werden)
• Blockierung der Elongation (Folge: frame-shift, wodurch andere Proteinvarianten synthetisiert werden können)
• Die Einflüsse können jeweils zur Initiation und Förderung, aber auch zur Inhibition, Hemmung einer Proteinsynthese führen. 

NMD ist ein Kontrollmechanismus und wirkt fehlerhafter mRNA entgegen. Diese Fehler können durch falsches Splicing, frame-shifts, oder Mutationen entstanden sein.
Die Exons der zu translatierenden mRNA besitzen EJCs (exon junction complex), welche signalisieren, dass sie ein Exon sind. Diese Komplexe werden beim ersten Ablesen der mRNA entfernt. Ist die mRNA fehlerhaft (z.B. Stop-codon vor noch weiteren Exons und EJCs), dissoziiert sich das Ribosom, die Translation hört zu früh auf, wodurch auch nicht alle Komplexe auf den Exons entfernt werden können und die mRNA wird abgebaut. 

ORF: open reading frame = Protein kodierende Regionen

• beginnt mit Startkodon (meist AUG)
• Endet mit Stopkodon (meist UUA, UAG, UGA)

UTRs: untranslatet Region

• bestitzen regulatorische Funktionen
• sekundäre Faltstrukturen
• Beeinflussen die mRNA Stabilität, Translationsinitiation und Translationsgeschwindigkeit

Kodon:

• enthält die Aminosäuressequenz
• besteht aus 3 aufeinanderfolgende Basen (Triplett Code)