Molekularbio

Nucleinsäurehybridisierung: Zwei Nucleotidstränge mit komplementären Basen bilden einen Doppelstrang. (Hybrid auch stabil, wenn nicht ganz komplementär)
=>Gen-Sonde = Nucleotidsequenz, welche für die Hybridisierung eingesetzt wird, werden radioaktiv, oder mit fluoreszierenden Gruppen markiert.

Immunscreening: Ein vom gesuchten Gen codiertes Protein wird mit Antikörpern identifiziert. Gen muss dazu von der transformierten Zelle exprimiert werden 

• ORI (für die Vermehrung des Plasmids),
• Polylinker (für die Insertion der DNA, enthält Reaktionsschnittstellen) und
• Selektionsmarker/Selektionsgen (Selektionieren von Bakterienzellen, die das Plasmid aufgenommen hat) 

Als Klonierungsvektoren kommen DNA-Elemente zum Einsatz, wie Plasmide, welche man aus Bakterien isoliert und den Anforderungen anpasst. Daneben lassen sich Bakterienviren und künstlich hergestellte Vektoren verwenden.

1)Plasmid: ringförmiges DNA-Molekül, repliziert unabhängig vom Bakterienchromosom. Plasmide besitzen unter Anderem eine DNA-Sequenz mit vielen Schnittstellen (Polylinker), in welche sich DNA-Fragmente integrieren lassen. Diese Polylinker sind häufig in die codierende Region eines Gens integriert, welches dadurch seine Funktion verliert. Das bewirkt eine Änderung des Phänotypen, was für eine Selektion nützlich ist.

2)Bakteriophage: Der λ-Phage ist ein Virus, der in modifizierter Form DNA-Sequenzen integrieren kann und ist somit ein nützlicher und viel verwendeter Klonierungsvektor. Cosmide sind eigentlich Plasmidvektoren, besitzen aber Abschnitte eines λ-Phagen, die sog. cos-Sequenzen.

3)Klonierungsvektoren: YAC-Vektoren (yeast), BAC-Vektoren (bacterial), HAC-Vektoren (human artificial chromosom)=>künstliche Chromosome

Plasmid: gut für kürzere klonierbare DNA-Sequenzen, einfach zu benutzen

λ-Phage: gut für kürzere klonierbare DNA-Sequenzen, hohe Transformationseffizienz

Cosmid: gut für mittellange klonierbare DNA-Sequenzen, hohe Transformationseffizienz  

BAC: gut für längere klonierbare DNA-Sequenzen, Stabilität langer Inserts
YAC: gut für sehr lange klonierbare DNA-Sequenzen, Stabilität langer Inserts 

Klonierungsvektoren = Vektoren, mit denen gewünschte DNA vermehrt wird.

Expressionsvektoren = Vektoren, die ihre Wirtszelle dazu veranlassen ein gewünschtes Produkt herzustellen. Dafür müssen sie die notwendigen regulatorischen Sequenzen für die Transkription und die Translation klonierter Gene enthalten:

Eine Zelllinie braucht das isolierte Gen, davor muss ein Promoter, der von der Zielzelle erkannt wird, eingebaut werden.
Signalsequenzen (Promoter, Terminator, Enhancer...)
Promoter-spezifische Polymerase 

Spezifischer DNA Nachweis führt immer über Basenpaarung zweier komplementärer DNAs (=Hybridisierung, Annealing)

Hybridisierung

• ein Vorgang, bei dem sich an ein Einzelstrang einer DNA ( Southern Blot) oder einer RNA (Northern Blot) ein mehr oder weniger vollständig komplementärer DNA- bzw. RNA-Einzelstrang anlagert.
• Hybridisierende DNA (Sonde), welche Radioaktiv oder Fluoreszierend markiert werden kann
• qualitativer Nachweis (vorhanden, oder nicht) und Aussage über Position in der Zelle

Sequenzierung  

• Sanger-Sequenzierung: 
  • Synthese beginnt an zugegenen Primer
  • endet durch statistischen Einbau eines Dideoxinucleotides (ddNTP)
  • Fragmente werden durch Elektrophorese der Länge aufgeteilt
  • Länge zeigt Postition der entsprechenden Base an da ddNTP Fluoreszierend sind
  • Abfolge der Farben auf der Längenleiter ergibt die Sequenz

Restriktionsanalyse  Behandlung mit spezifischen Restriktionsenzymen (schneiden DNA spezifisch an Erkennungssequenzen), Auftrennung mittels Gelelektrophorese und Analyse

=>Southern Blot: nach Gelelektrophorese: Stränge durch Alkalien spalten, auf Membran übertragen (blotting), Hybridisieren, oder Färben und analysieren.
 

PCR:  Man kann bekannte Teilsequenzen vervielfältigen (falls vorhanden) und nach Anfärben nachweisen. 

Die PCR eignet sich für den Nachweis von kurzen Genstücken. Sie ist jedoch fehleranfällig und hat eine tiefe Nachweisgrenze 

• Denaturierung
  • Stränge trennen sich bei 90C
• Annealing
  • Primeranlagerung
• Extension
  • Strang wird durch Polymerase komplementär ergänzt

Die nachzuweisende RNA muss zuerst durch das Enzym Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben werden.
Northern Blot: RNA ist schon einzelsträngig, sie muss nicht mehr aufgetrennt werden. Die benutzte Gensonde besteht dafür aus DNA und nicht aus RNA, wie beim Southern Blot. 

enzymatische Methode

• Die DNA wird ausgehend von einem synthetisch hergestellten Primer durch DNA Polymerase neu synthetisiert. Dabei ist neben der normalen dNTP auch ein wenig ddNTP vorhanden. (ddNTP fehlt die 3’OH-Gruppe an der Ribose=>DNA-Moleküle mit ddNTP können nicht verlängert werden.)
• Entweder ein ddNTP, oder der Primer werden zum Nachweis der neu synthetisierten DNA radioaktiv, oder mit fluoreszierender Gruppe markiert.
• Das entstandene Gemisch wird mittels Gelelektrophorese getrennt. Um zu unterscheiden, welches ddNTP an welcher Stelle eingebaut wird, werden entweder vier Reaktionsansätze mit je einem ddNTP, oder ein Reaktionsansatz mit vier ddNTPs gemacht, wobei diese dann unterschiedlich gefärbt sind. 

• Durch Verteilung von DNA tragenden Partikeln auf einer Oberfläche wird erreicht, dass ein definiertes DNA-Molekül an einer bestimmten Messposition fixiert ist und sich vermehren kann.
• Anschließend wird die Sequenz der DNA durch Synthese ermittelt.
• Bei der Pyrosequenzierung wird ein bei der Polymerisation frei werdendes Pyrophosphat in ein Lichtsignal umgesetzt. Es kann nur ein Lichtsignal erzeugt werden, wenn ein Nukleotid an der augenblicklich letzten Position der DNA eingebaut werden kann. 

Gemeinsamkeit: Man erhält kurze, für viele Anwendungen nützliche DNA-Sequenzen.

Vergleich: Bei der Pyrosequenzierung wird keine Gelelektrophorese gemacht (empfindlich), sondern während der DNA-Synthese, welche schrittweise verläuft, gemessen, bei welchem der unterschiedlichen dNTPs, die zugegeben werden, eine Verlängerung der Ziel-DNA stattfindet. (schrittweise immer verschiedene dNTPs) Beim Einbau der dNTPs wird ein Lichtsignal abgegeben. 

Hybridisierung

Der Nachweis einer bestimmten DNA-Sequenz erfolgt über eine Interaktion (= Hybridisierung ) mit einem Stück komplementärer DNA (Sonde).
Die Ziel-DNA wird durch Hitze- oder Alkalibehandlung denaturiert, eine Renaturierung folgt in Anwesenheit einer Sonde.

(Sonde = gleiche, oder ähnliche Sequenz, wie die Ziel- DNA, radioaktiv, oder fluoreszierend, oder antigene Gruppen dran)

=>Am Ort der Hybridisierung gibt es ein nachweisbares Signal. 

paralog:

zwei homologe DNA-Sequenzen, oder Gene, welche innerhalb einer Spezies durch eine Duplikation entstanden sind
=>Zwei Gene sind zu einander paralog, wenn ihr gemeinsames Vorläufergen eine Genverdopplung durchlaufen hat.

ortholog:

homologe DNA-Sequenzen, oder Gene, welche durch vertikale Abkunft von einem gemeinsamen Vorfahren verwandt sind
=>Zwei Gene sind zu einander ortholog, wenn ihr gemeinsamer Urahn ein Artbildungsereignis durchlaufen hat.

fünf homologe Gene
3a und 3b sind paralog zu einander und ortholog zu den restlichen Genen

• Genom: gesamte Erbinformation im Zellkern einer Zelle
• Chromodrom: gesamte Erbinformation enthalten in Chloroplasten einer Zelle
• Plastom: gesamte Erbinformation enthalten in Plasmiden einer Zelle 

Chromatin:

• Das Chromatin ist ein Komplex der DNA im Zellkern und verschiedenen Proteinen (hauptsächlich Histone)
• funktionale Organisationsform.
• Chromatin ist aufgebaut aus kettenförmig aneinandergereihten Nukleosomen.

Nukleosom:

• Die grundlegende Funktionseinheit des Chromatins bei Eukaryonten 
• ein Komplex aus acht Histon-Proteinen umgeben von etwas. 

Heterochromatin: =>Chromatin fest gepackt/dicht

• kondensiert, inaktive Genexpression

Euchromatin: =>Chromatin als relativ lockere Fadenknäuel 

• dekondensiert, aktive Genexpression (DNA zugänglich für Expressionsmaschinerie)

A) 8 Histone machen ein Nucleosom und um das ist dann die DNA gewickelt.

B) Acthylierung, Methylierung, Phosphorylierung, Glykosylierung

C) Chromatin kommt als: 

• Euchromatin ist in einer lockeren Struktur, sodass die Informationen leichter zugänglich sind und abgelesen werden können.
• Heterochromatin ist dichter gepackt/verpackt, sodass dieser Teil nicht abgelesen wird. 

Reprimierende (hemmen Genexpression), oder heterochromatine Strukturen tendieren dazu, sich auszubreiten.
Beispiel: Heterochromatin-Protein 1 bindet an methylierte Stelle, aktiviert dadurch Su(var(3-9))-Protein (sorgt für eine fortlaufende Methylierung von H3K3), neues HP1 an neu methylierte Stelle, etc.

{H3K3: Histon3 wurde am Lysin (K) in Position 9 modifiziert} 

Histonmodifikation = chemische Veränderung an Histon-Proteinen, hat Einfluss auf die Transkription. Die Interaktion von Histonen und der DNA wird von der Histonmodifikation gesteuert. Die Modifikationen können die Chromatinstruktur und somit Genaktivität verändern.

Histon-Code-Hypothese: Die Hypothese besagt, dass die Kombination verschiedener Histon-Modifikationen durch bindende Proteine abgelesen und deren Zusammenwirken zu bestimmten biologischen Prozessen führt.
 

Histon-Code: „Karte“ was auf dem Histon alles methyliert, acetyliert, phosphoryliert und ribolysiert werden kann (post-translational). Die Methylierung/A./P./R. an einer Stelle hat Einfluss auf die M./A./P./R. an einer anderen Stelle (viele Möglichkeiten für Modifikationen), sowie auf die Interaktion der Histone mit der DNA.

=>Der Informationsgehalt der Modifikationsmuster wird als Histon-Code bezeichnet.

In Tier- und Pflanzenzellen kommen 5 Typen von Histonen vor:
H1, H2A, H2B, H3, H4
Gemeinsamkeit: Alle Histone bestehen aus einer zentralen globulären Domäne und flexiblen Armen mit vielen positiv geladenen Aminosäuren. 

Acetylierung von Lysin

Methylierung von Lysin, oder Arginin

Phosphorylierung, Ribosylierung, Glycosylierung... 

• meist aktivierende Wirkung auf Genexpression (da Interaktion mit DNA aufgehoben) 
• variable Modifikation

• positive & negative Korrelation mit Transkription, meist aber repressive (hemmende) Wirkung auf Genexpression (wegen sterischer Hinderung) 
• stabilere Modifikation

• Trithorax und Pc sind besonders für die Regulation von Genen wichtig, die bei der Entwicklung eines Organismus eine Rolle spielen.
• Das Genexpressionsmuster (manche Gene exprimiert, andere nicht) wird von P&Th weitervererbt.
• Sie lesen den Histon-Code indem sie an modifizierte Histone binden und Prozesse an der DNA auslösen.

P: stabilisieren Heterochromatin; erkennen Histonmodifikaitonen und unterdrücken die dortige Genexpression
Th: stabilisieren Euchromatin; binden an best. Chromatinregionen und aktivieren Gene 

• Die Aktivität eines Gens Variiert je nach Position im Chromosom, also je nach Genomumgebung.
• Das Gen ist zum Beispiel aktiv in einer euchromatischen Region,
• in einer heterochromatischen Genomumgebung ist es inaktiv.

PEV (Position Effect Variegation) beschreibt den Einfluss auf die Wirkung eines Gens durch eine Veränderung seiner Position innerhalb des Genoms. 

Die Epigenetik befasst sich mit der Vererbung von erworbenen Eigenschaften während der Zelldifferenzierung, oder auch zwischen den Generationen. (=>vererbbare Veränderung der Genaktivität, die nicht durch die DNA-Sequenz codiert wird, aber durch RNA-Stabilität, Chromatinstruktur und Kernarchitektur bestimmt wird) 

• RNA-Interferenz ist ein natürlicher Prozess welcher der zielgerichteten Abschaltung von Genen dient

Mechanismus:

• Doppelsträngige (ds)RNA wird von einer ATP abhängiger Ribonuclease (Dicer) in kurze RNA (siRNA) geschnitten
• siRNA wird in einem Enzymkomplex gebunden
  • siRNA bindet an RISC: bindet an RNA und induziert Schnitte --> sekundäre siRNA wird produziert und Translation kann gehemmt werden
  • siRNA bindet an RITS: bindet an Transkripte und stört Transkription oder Rekrutierung von Chromatinmodifizierenden Proteine

Ausgelöst wird die RNAi durch dsRNA (mit Sequenzidentität zu einem Teil des Zielgens), welche durch Dicer in siRNA zerlegt wird.
transkriptional: siRNA-Strang wird von Enzymkomplex RITS gebunden. RITS interagiert mit DNA, oder mit eben bildender mRNA (führt zu Chromatinmodifikationen). post-transkriptional: siRNA-Strang wird von Enzymkomplex RISC gebunden. siRNA leitet RISC zu komplementärer mRNA, welche dann geschnitten und inaktiviert wird. 

• Beim Gene Silencing wird die Genexpression gemindert:
• Hemmung der Übertragung einer Information bei der Transkription (DNA->mRNA), oder bei der Translation (mRNA->Protein)
• DNA-Elemente, welche die Bindung von Expressionshemmern an Transkriptionsfaktoren bewirken heissen „Silencer“. Das Gegenteil wären „Enhancer“. 

Enhancer setzen sich aus Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren zusammen und können dadurch zellspezifisch wirken. Sie beeinflussen die Anlagerung des Transkriptionskomplexes an den Promotorund verstärken somit die Transkriptionsaktivität eines Gens.

• dsRNA wird von Dicer (ATP-abhängige Ribonuclease) in siRNA zerschnitten

• siRNA wird in einen Enzymkomplex gebunden: RISC

  • siRNA leitet RISC zu komplementären Sequenzen in anderen RNAs
    RNA: Basenpaarung, dann inaktiviert, oder zerschnitten: von RNA- abhängiger Polymerase zu dsRNA (die dann zu siRNA wird, etc.)

• siRNA bindet an RITS-Komplex, löst Prozesse am homologen Chromatin aus

  • Komplex interagiert mit DNA, oder RNA, die gerade gebildet wird; bewirk Chromatinmodifikation (führt zu transkriptionellem Gensilencing)

=>siRNA:
mobil, können vom Entstehungsort wegtransportiert werden
Herstellung: intermolekulare Basenpaarung zweier unabhängig von einander produzierte RNA-Stränge, oder durch „hairpin“-Struktur („inverted repeat“)
Mit siRNA kann man gezielt Gene inaktivieren, um dadurch ihre Funktion zu studieren. 

Imprinting, oder Chromosomeninaktivierung führt dazu, dass es bei der Vererbung nicht immer egal ist, von welchem Elternteil Allele vererbt werden.

• Es beruht auf der Methylierung von DNA und der Modifikation von Histonen.
• Das Allel eines Elternteils wird durch spezifische Methylierung inaktiviert (Gene-Silencing).
• Imprintete Regionen sind also "spezifisch methylierte Regionen". Dieses Imprinting wird mitvererbt und setzt so die Mendelschen Regeln außer Kraft.
• Die codierende DNA- Sequenz beider Allele bleibt jedoch unverändert. 

Die weiblichen Keimzellen enthalten mehr Zytoplasma, als die männlichen Keimzellen. Somit wird auch überwiegend das Plastom und Chromodom über die maternale Linie weitergegeben. 

• Ein Prion ist ein Protein, welches in tierischen Organismen vorkommt und weitervererbt werden kann.
• Die Konformation bestimmt die Funktion. (krankmachende Konformation kann z.B. BSE bei Rindern auslösen) 

• Die DNA-Polymerase kann Nukleotide nur am 3’-Ende anfügen. Somit läuft die DNA-Replikation immer nur in 5’-3’-Richtung.
• Beim „leading strand“ können die Nukleotide kontinuierlich angefügt werden und ein Primer reicht somit aus.
• Beim „lagging strand“ kann die DNA-Polymerase immer nur Teilstücke replizieren, sog. Okasaki-Fragmente, welche danach von der Ligase zusammengefügt werden. Jedes Teilstück braucht dabei einen Primer. 

• Eine Funktion der DNA-Polymerase ist auch die Kontroll- und Korrekturfunktion.
  • Proofreading: Sie kann falsch eingebaute Nukleotide dank ihrer 3’-5’-Nukleaseaktivität wieder entfernen.

Zwischen den Phasen des Zellzyklus befinden sich sog. Kontrollpunkte, wo überprüft wird, ob die vorangehende Phase korrekt abgeschlossen wurde, bevor die nächste Phase beginnt. Sie bestimmen Dauer&Abfolge der Phasen.

• Beim Eintritt aus G0, oder G1 in die S-Phase wird von Proteinen (Cykline, cyklinabhängige Kinasen...) kontrolliert, ob die DNA Schäden hat, oder eine Nährstofflimitierung.
• In der S-Phase verdoppelt sich der Chromosomensatz.
• In G2 wird die Qualität der Replikation kontrolliert.
• In der M-Phase wird kontrolliert, ob alle Chromosomen gebunden sind. 

Ein Telomer ist die DNA-Sequenz, welche das Ende eines Chromosomes bezeichnet. Sie hat einen hohen G- und T- Gehalt, ist sehr repetitiv und wichtig für die Stabilität eines Chromosoms, wobei auch die gefaltete Sekundärstruktur der Telomere zur Stabilität beiträgt.

Bei jeder Zellteilung geht ein Stück der Telomere verloren, da der Primer nicht ersetzt werden kann (Alterung der Zelle). Das Enzym Telomerase kann diese Verkürzung in bestimmten Zellen wieder ausgleichen.