10 Blut - Gloor

• Kreuzreaktivität bedeutet, dass ein Antikörper "sein" Epitop auch auf einem anderen Antigen findet
• Kreuzreaktivität wird oft bei polyklonalen Antikörpern beobachtet; kommt bei monoklonalen Antikörpern selten vor
• aber: Antikörper sind in der Regel äusserst spezifisch für ein Antigen.

Polyklonale Antikörper sind Mischungen von verschiedenen Antikörpern, die aus dem Serum von immunisierten Tieren (meistens Ziege, Kaninchen, Maus oder Ratte) gewonnen werden.^[1] Durch Adsorption an ein Antigen in einer Affinitätschromatographie können alle Antikörper gegen die verschiedenen Epitope eines Antigens gemeinsam aufgereinigt werden, obwohl die Antikörper von verschiedenen B-Zellen produziert wurden.

Im Gegensatz dazu wird ein monoklonaler Antikörper nur von Klonen einer einzelnen B-Zelle hergestellt und ist daher auch nur gegen ein einzelnes Epitop eines Proteins gerichtet. Polyklonale Antikörper stellen im Gegensatz zu monoklonalen Antikörpern ein natürliches Gemisch dar.

sB

• DNA Sequenzanalyse zeigt, dass in den variablen Domänen der leichten und schweren Ketten an 3 Stellen grosse Sequenzvariabilität existiert
• auf Aminosäurestufe werden diese 3 Stellen als CDR1 (AS Position 30), CDR2 (AS Position 50) und CDR3 (AS Position 95) bezeichnet

Ursprung der Diversität in den drei CDR Regionen
• CDR1 Diversität entsteht vor allem durch somatische Hypermutation (noch nicht besprochen)
• CDR2 Diversität ist die Folge der Existenz vieler Exone
• CDR3 Diversität entsteht vor allem durch Rekombinationsunterschiede und
Nukleotideinbau

• die variable Domäne der κ leichten Kette wird in 2 Exonen codiert: V- und J-Exon
• das V-Exon codiert bis zur Aminosäure 95, das J-Exon codiert bis zur Aminosäure 110
• menschliche DNA hat mehr als 70 V Exons, aber nur ca. 35 davon sind funktionell aktiv
• menschliche DNA hat 5 J Exons
• V- und J Exone werden während der B-Zellendifferenzierung rekombiniert
   => Variabilität

• in λ leichten Ketten sind 7 J-Exone an die Exone der konstanten Ketten gekoppelt
• V- und J/C Exone werden während der B-Zellendifferenzierung rekombiniert => Variabilität

• leicht unterschiedliche Rekombination zwischen den gleichen V- und J-Exonen der leichten Ketten führt zu anderen DNA Sequenzen
=> Variabilität, sofern die neue Rekombination das Leseraster beibehält

• die variable Domäne der schweren Ketten sind in 3 Exonen codiert: V-, D- und J-Exon
• die D-Exone sind sehr kurz, existieren in ca. 30 Formen und können in jedem Leseraster rekombiniert werden
• die Rekombination an der Verbindungsstelle von V, D und J generiert die Diversität in CDR3
=> Variabilität

Diversität in schweren Ketten durch variable Rekombination und Aktivität einer DNA Polymerase

• leicht unterschiedliche Rekombination zwischen den gleichen V- und J-Exonen der schweren Ketten führt zu anderen DNA Sequenzen
=> Variabilität, sofern die neue Rekombination das Leseraster beibehält

• zwischen VH und D sowie zwischen D und JH können Nukleotide eingebaut werden durch das Enzym terminale Desoynukleotidtransferase (eine DNA-Polymerase, die keinen Matrizenstrag benötigt)
=> Variabilität, sofern die zusätzlichen Nukleotide das Leseraster in das Folgeexon beibehalten bzw. kein Stopcodon bilden

Als somatische Hypermutation wird das Einfügen von Mutationen in die Antikörpergene einer reifenden B-Zelle bezeichnet. Es handelt sich um einen wichtigen Schritt des adaptiven Immunsystems.

• somatische Hypermutation kommt nur bei der finalen Reifung der B-Zellen vor
• somatische Hypermutation trittt in den V- und J-Exonen der leichten und in den V-, Dund J-Exonen der schweren Ketten auf
• somatische Hypermutationen sind individuumsspezifisch (werden nicht vererbt)
• somatische Hypermutationen führen in der Regel zu einer Erhöhung der Affinität des Antikörpers zum Antigen

Wie funktioniert die somatische Hypermutation?
am Vorgang sind 3 Enzyme hauptsächlich beteiligt: 
activation-induced (cytidine) deaminase (AID) 
uracil-N-glycosidase (UNG) 
error-prone DNA polymerase

-> einbringen von Mutationen durch en nachlässiges reperatursystem

polyklonale Antikörper
• polyklonale Antikörper haben grosse Bedeutung in medizinischer Forschung und Diagnostik
• polyklonale Antikörper haben nur eingeschränkte Bedeutung in der Therapie: die Antikörper sind Fremdproteine d.h. Antigene, Neutralisation durch Anti-Antikörper verschiedene Chargen polyklonaler Antikörper sind heterogen, da verschiedene Tiere immunisiert werden
• Einsatzbeispiel: rasche Neutralisation tierischer Gifte

monoklonale Antikörper
• monoklonale Antikörper haben grosse Bedeutung in medizinischer Forschung, Diagnostik und Therapie
monoklonale Antikörper sind homogen (nur ein Typ)
monoklonale Antikörper können durch gentechnologische Methoden “humanisiert werden”
monoklonale Antikörper können durch moderne kombinatorische Methoden (phage display) und Expression in menschlichen Zellen vollständig “human” gemacht werden
• Haupteinsatzbgebiete: Onkologie, Immunologie, virale Infektionen, Gerinnungshemmung

• Immunogenizität beim Menschen (der Antikörper ist ein Antigen)
• Affinität zum Antigen
• Stabilität und biologische Halbwertszeit
• Effektorfunktionen:
Komplementaktivierung
Makrophagenaktivierung
• Verteilungsfähigkeit im Gewebe

Was sollen therapeutische Antikörper tun?
• sie können Ligand-Rezeptor Wechselwirkung blockieren
• sie können anstelle des natürlichen Liganden an einen Rezeptor binden und ein intrazelluläres Signal auslösen (z.B, Apoptose)
• sie können andere Komponenten des Immunsystems rekrutieren

Die Humanisierung eines Antikörpers zwecks Reduktion der Immunogenizität

Identifikation von Antigenen in biologischen Proben: Western Blot (qualitative Methode)
• Auftrennung von Proteinen nach Masse (SDS-PAGE)
• Transfer der Proteine auf eine Membran
• immunologischer Nachweis des gesuchten Proteins (Antigens)
• Information: Anwesenheit des Antigens, Masse des Antigens

Identifikation von Antigenen in biologischen Proben: ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, quantitative Methode)
• Präsentation des Proteins
• immunologischer Nachweis des gesuchten Proteins (Antigens)
• Information: Anwesenheit des Antigens Menge/Konzentration des Antigens, Affinität des Antikörpers zum Antigen (Kd)

die Blutstillung ist ein Zusammenspiel von:
• vaskulären Vorgängen: Gefässkontraktion durch Freisetzung von u.a. Serotonin aus der verletzten Gefässwand und aus Thrombozyten
• zellulären Vorgängen: Adhäsion und Aggregation von Thrombozyten an subendotheliale Matrixproteine (Laminin, Kollagen, Fibronectin): primäre Hämostase
• plasmatischen Vorgängen: Aktivierung von Gerinnungsfaktoren und Ausbildung von Fibrinpolymeren: sekundäre Hämostase

Thrombocytenadhäsion:
• Thrombocyten binden mit Membranrezeptoren an Laminin, Kollagen und Fibronectin der subendothelialen extrazellulären Matrix
• diese initialen Adhäsionsnteraktionen sind jedoch bei gegebenem Blutfluss nicht stark genug. Und: Adhäsion zwischen Thrombozyten ist ebenfalls nötig => Auslösung zusätzlicher Wechselwirkungen

Thrombocytenaktivierung:
• weitere Wechselwirkungen werden durch von-Willebrand-Faktor (vWF) ausgelöst
• vWF zirkuliert im Plasma (Komplex mit Faktor VIII) und ist in subendothelialer Matrix deponiert (aus Endothelzellen)
• vWF verstärkt Adhäsion von Thrombocyten an Matrix
• Der Komplex vWF-Faktor VIII aktiviert Thrombocyten
=> Ausbildung von Pseudopodien und Interaktion der Thrombocyten mittels Fibrinogen => Thrombus. Endgültige Stabilisierung durch Fibrineinbau

das lösliche Protein Fibrinogen muss in ein fasriges Polymer überführt werden, das zusammen mit den Thrombocyten den Thrombus bildet:
• das Gerinnungssystem ist als doppeltes enzymatisches Kaskadensystem (Aktivierungssystem) aufgebaut
• doppelt bedeutet: ein extravaskuläres (exogenes) System und ein intravaskuläres (endogenes) System sind beteiligt
• beide Systeme konvergieren mit den Gerinnungsfaktoren V und X (FX, FV)
• die beteiligten Enzyme sind Serinproteasen
• die zuletzt aktivierte Protease ist Thrombin (aus Prothrombin)
• Thrombin entfernt kurze Peptide von Fibrinogen => nicht kovalente Polymerisation von Fibrinogen zu Fibrin
• Thrombin aktiviert zusätzlich FXIII
• FXIIIa verknüpft die Fibrinfibrillen kovalent

• an der Gerinnung sind 13 Faktoren beteiligt
• Faktor IV (FIV) ist Ca2+, alle anderen Faktoren sind Proteine
• die Faktoren II, VII, IX, X, XI und XII sind Proteasen
• Startpunkt für das extravaskuläre System ist Gewebethromboplastin (tissue factor): Membranprotein, konstitutiv von nichtvaskulären Zellen exprimiert
• das extravaskuläre System aktiviert Thrombin in Sekunden
• das intravaskuläre System läuft erst nach einigen Minuten an
• ein wichtiger Cofaktor für die Gerinnungskaskade ist Ca2+

• Ca2+–Ionen binden FII, VII, IX und X durch Komplexbildung an die Thrombocyten
• Ca2+-Ionen können 6 Kooridnationsbindungen eingehen:
seitens der Gerinnungsfaktoren kommen freie Elektronenpaare modifizierter Glu Seitenketten: γ-Carboxy-Glutamat (Gla)
seitens der Thrombozytenmembran kommen freie Elektronenpaare der Phosphatgruppen der Phospholipide

sB

die Polymerisation von Fibrinogen zu Fibrin:
• Startpunkt sind lösliche Fibrinogenmoleküle, an welchen Thrombin durch Hydrolyse von Peptidbindungen kurze N-terminale Peptide entfernt: Fibrinopeptide A und B
=> die neu exponierten N-terminalen Enden wechselwirken nicht-kovalent (H...Brücken, hydrophobe WW) mit C-terminalen Fibrindomänen
• FXIIIa verknüpft Fibrinpolymere kovalent
• Fibrinpolymere lagern sich zu „Proteinfasern“ zusammen => vollständiger Thrombus

die Struktur von Fibrinogen:
• Fibrinogen ist ein homodimeres langestrecktes schweres Protein (ca. 340‘000 g/mol)
• jedes „Monomer“ besteht aus 3 Polypeptidketten => insgesamt 6 Polypeptidketten
• die 3 Polypeptidkettten (α, β, γ) sind untereinander über S–S Brücken verküpft
• die beiden Monomere sind über S–S Brücken verknüpft
• die 3 Ketten bilden eine Tripelhelix
• β- und γ-Untereinheit haben strukturierte hydrophobe C-terminale Domäne
• α-Kette hat unstrukturierte C-terminale Domäne

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Die Fibrinolyse:
• die Proteasen der Fibrinolyse (Gewebe-PA (t-PA), Plasmin) sind ebenfalls Serinproteasen
• t-PA ist in Gefässen an Endothelzellen gebunden, wird durch Thrombin freigesetzt
• t-PA bindet Fibrin sehr gut, wird aber auch schnell durch Serinproteaseninhibitoren (Serpine) inaktiviert
• t-PA enfaltet bereits als Proenzym katalytische Aktivität
• Plasmin inaktiviert zusätzlich die Faktoren V und VIII und kann Fibrinogen abbauen

Heparin (bzw. Heparansulfat):
• Heparine sind Zuckerpolymere bestehend aus sulfatierten Aminozuckern (Masse zwischen 4000 und 40‘000 g/mol)
• Heparine binden an das Serpin AT III (an Lysinseitenketten)
=> stark erhöhte Bindungsaffinität von AT III an Thrombin (und andere Gerinnungsproteasen)
  => Gerinnungshemmung

Calciumchelatoren:
• Citrat und Oxalat sind natürliche Calciumchelatoren
• EDTA ist ein synthetischer hochaffiner Calciumchelator

Vitamin K ist ein Cofaktor im Prozess der Glutaminsäure Carboxylierung

Vitamin K Antagonisten wirken als kompetitive Hemmstoffe der Carboxylierung
=> Hemmung der Blutgerinnung

Das Protein C und Protein S System:
• Protein C ist eine Protease, wird durch Carboxylierung von Glutaminseitenketten (Vitamin K abhängig) modifiziert wird
• Aktivierung von Protein C erfolgt durch Thrombin, insbesondere wenn Thrombin an Thrombomodulin (TM) gebunden ist (Änderung der Substratspezifität)
• der Komplex Protein C–Protein S inaktiviert die Faktoren Va und VIIIa

Serpine:
• eine Familie strukturell ähnlicher Proteine, die Serinproteasen irreversibel hemmen
• Serpine verhalten sich wie ein Substrat, verhindern jedoch durch Konformationsänderung den Deacylierungsschritt des Enzym-Substrat Komplexes

• die meisten an der Gerinnung beteiligten Proteine sind Proteasen
=> ihre Aktivität muss kontrolliert sein
• allgemeine mögliche Kontrollmechanismen sind: geringe Konzentration, Aktivierung durch andere Enzyme, hohe Substratspezifität, Kompartimentalisierung, Regulation über Cofaktoren, spezifische Inhibitoren (z.B. auch andere Proteasen)
Aber:
• die Gerinnung muss bei Bedarf auch rasch einsetzen
=> Proteasen sind „langsam“
• eine Kaskade bewirkt eine grosse Verstärkung der enzymatischen Aktivität, die Startmoleküle sind nur gering konzentriert und es existieren viele Regulationsorte

sB

• ein Mangel an Hemmstoffen der Gerinnung begünstigt die Bildung von Thromben • häufigste Ursache für Thrombenbildung ist APC-Resistenz: das aktivierte Protein C kann Faktor Va nicht spalten (abbauen), da eine Mutation im Faktor V-Gen die Aminosäure an der proteolytischen Inaktivierungsstelle von Va verändert hat
=> „optimale“ Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin