Zellbiologie Vetmed 1. JK

Heteropolymer: verschiedene Sequenzen an N- und C-terminalen Domänen

Sind erheblich stabiler als Mikrotubuli und Mikrofilamente

muss während Zellzyklus umgebaut werden und während Zytokinese weitgehend aufgelöst werden, vor der Mitose werden sie unter dem Einfluss der cdc2-Kinase (CDKs) abgebaut und nach der Zellteilung wieder neu gebildet.

saure und basische Keratine, in Epithelzellen exprimiert, stets Herterodimere im Verhältnis 1:1, vebinden sich zu Kerationfilamenten aus etwa 10 Keratine => spezifisch für harte Epithelschichten wie Nägel, Haare, Wolle

Vimentin, Desmin und Peripherin: homo- oder heteropolymere Intermediärfilamente,

Vimentin am weitesten verbreitet (Leukozyten, Endothelzellen der Blutgefässe, andere Epithelien, mesenchymale Zellen wie Fibroblasten)

Desmin: in Muskelzellen für Stabilisierung von Sarkomeren

Neurofilamente, Kommen als heteropolymere Proteine in Axonen der Nervenzellen vor

Lamine: Ausschliesslich im Zellkern

in perlenschnurartigen Filamenten in Augenlinsen=> nur wenige Ähnlichkeiten  mit anderen Typen

rein strukturelle Aufgaben, keine Bewegungsabläufe oder Motorproteine

oft an Membranen, die durch Filamente mechansich versteift werden (Kernlamina die an innerer Seite der Kernmembran ist)

in Zytosol typischerweise in Strängen von Kernmembran zu Plasmamembran ziehend

vermitteln Wechselwirkungen zwischen einzelnen Intermediärfilamenten und verknüpfen diese zu Bündeln oder Netzwerken

für Bindung von Intermediärfilamenten an Zellstruktur (Zellmembran)

Vernetzung mit Mikrotubuli

Hauptaufgabe: Intermediärfilamente mit anderen Strukturen in Zelle vernetzen=> Stützfunktion, evt. auch Vernetzung mit Aktinzytoskelett 

Ermöglichen alle Zellbewegungen in dem sie chemische Energie (aus ATP) in Bewegung umsetzen => Transport biologischer Lasten oder zelluläre Bewegungen

Aktinfilamente und Mikrotubuli dienen als Schiene

Kopfgruppe: bindet an  Zytoskelett und führt unter ATP-Verbrauch Konformationsänderung für Bewegung entlang der Schiene aus

Schwanzdomäne: interagiert mit der zu  transportierenden Organellen

Bei Muskelkontraktion, Zytokinese und Vesikeltransport wichtig

18 Mitglieder der Myosingenfamilie

Myosin I und II: in fast allen Zellen

Myosin V: weniger weit verbreitet

in Nichtmuskelzellen sind Aktin- und Myosinfilamente an Kontaktstellen der Zellmembran mit dem Substrat oder anderen Zellen, ziehen sich ausserhalb der Zelle bei ATP-Zugabe zusammen

aus einer oder zwei schweren Ketten und mehreren leichten

schwere Ketten gegliedert in Kopf, Hals und Schwanzdomäne, Schwanzdomäne bestimmt Funktion des jeweiligen Myosintyps

die leichten Ketten sind am Hals , die schweren Ketten bilden das ganze Ding

Myosind I hat eine schwere, II und V haben 2 schwere Ketten

leichte Ketten des Myosin I und V : Calmodulin

Leichte Ketten von myosin II: essenzielle leichte ketten und regulatorische leichte Ketten

• generiert Kraft für Muskelkontraktion
• Quervernetzung des Aktinzytoskeletts als Stütz- und Verstärkungsfunktion für Plasmamembran
• Ausdehnung der Zelle, Bildung von Filopodien, Membrankräuselungen und Stressfasern
• Zelladhäsion und Regulation der Gestalt der Zelle
• Während der Zytokinese: Bildung des kontraktilen Ring und Teilen der Zelle in zwei Teile
• intrazellulärer Transport von Vesikeln durch Myosin I und V

• intrazellulärer Transport von Membranvesikeln, Organellen und Chromosomen
• Membranvesikel Geschwindikeit: 250 mm /Tag => 3 Mikrometer/s=> schnellster intrazellulärer Transport
• polymerisierte Zytoskelettbestandteile Geschwindigkeit: nur Bruchteile eines Millimeters pro Tag
• 14 verschiedene Kinesinfamilienangehörige
• Unterteilt in zytosolische Kinesine und Spindelkinesine

3 Domänen:

1. zwei grosse globuläre Kopfdomänen
2. langer Stiel (Verbindung)
3. paar kleiner globulärer Schwanzdomänen

Funktionen der Domänen:

1. binden an Mikrotubuli und ATP
2. verbinden Kopf und Schwanz
3. Bindung an Membranvesikel (Membranvesikel=Fracht von Kinesin

• Rezeptoren an Vesikel bisher nicht identifiziert,
• transportieren Vesikel vom Minus- zum Plus-Ende des stationären Mikrotubuli,
• zweiköpfiges Kinesinmolekül wandert in 8nm-Schritten (=Abstand zweier alpha- und beta Tubulinuntereinheiten in Protofilament)
• Kraft jeweils 6 pN pro Schritt

• Vesikel- und Organellentransport entlang von Mikrotubuli vom Minus- zum Plus- Ende (das Protein KIF1B transportiert zum Beispiel ausschliesslich Mitochondrien, während das verwandte Protein KIF1A für den Transport von synaptischen Vesikeln zum Axonende zuständig ist) 
• Aufbau des Spindelapparats und Trennung der Chromosomen während der Zellteilung 

Dynein ist ein Mikrotubulimotorprotein, transportiert die Fracht vom Plus- zum Minus-Ende => für retrograden axonalen Transport oder Wanderung endozytotischer Vesikel (Stoffe darin müssen abgebaut werden) von der Plasmamembran zu Lysosomen

• ist in grossen multimeren Proteinkomplexen mit Molekulargewichten über einer Milion Dalton,
• aus 2 oder drei schweren Ketten und nicht genau bestimmte Anzahl mittelschwerer und leichter Ketten
• Unterteilung:
• zytosolische Dyneine (Vesikel und Chromosome bewegend), wie Kinesin, doppelköpfig, Kopfgruppen von zwei gleichen oder fast gleichen schweren Ketten gebildet
• Axonemdyneine

Können alleine keine Frachten transportieren, bruachen grossen Komplex von Mikrotubuli-bindenden Proteinen (MBPs), der Vesikel und Chromosomen mit Mikrotubuli verknüpft aber keine Bewegung hervorrufen kann

Kinesin wirkt in Gegenrichtung von zytosolischem Dynein=> Bewegung wird so reguliert

•  Vesikeltransport entlang von Mikrotubuli vom Plus- zum Minus-Ende (aussen -> innen) 
• Axonemdyneine verschieben Mikrotubuli gegeneinander und bewirken so die Schlagbewegung von Zilien und Flagellen 
• Positionierung von Organellen und der mitotischen Spindel 

Protozoen und Metazoen

Sie verkleben die Zellen untereinander oder befestigen sie an der extrazellulären Matrix. bilden so kohäsive Einheit

Formaldehyd denaturiert und fixiert die Proben.

Ausserdem vernetzt es die Aminogruppen benachbarter Moleküle => Kovalente Bindungen entstehen, die Proteine untereinander und mit Nukleinsäuren verknüpfen

Dadurch werden Moleküle unlöslich und sind bei weiterer Behandlung der Probe stabil=> dünne Schnitte können hergestellt werden

Gefrieren und dann schneiden

Problem: Farben fehlen, alle absorbieren sichtbares Licht etwa im gleichen Masse => nichtmal Zellkern sichtbar evt

Eosin an basischen Aminosäuren, Hämatoxylin an sauren Molekülen.

Produkt der Vergrösserungen von allen einzelnen Linsen

0.2 Mikrometer, macht also Mitochondrien (1 Mikrometer lang) sichtbar

Farbstoffe wie Rhodamin, Cy3 oder Fluorescein werden verwendet, die zum Beispiel an Antikörper binden

Dieser Antikörper bindet dann an sein Antigen

Der Effekt der Fluoresenz kommt jetzt bei Bestrahlung mit Anregungslicht: die fluoreszendierende Bindung absorbiert das einfallende Licht und sendet dann sichtbares Fluoresenzlicht mit längerer Wellenlänge aus

auch Immunfluoreszenzmikroskopie genannt

das Fluoreszenzlicht aus verschiedenen Lagen überlagert sich. 

Lösung: konfokale Fluoreszenzmikroskopie: ein kleiner Teil wird jeweils mit einem fokussierten Laserstrahl, der sich schnell über die Probe bewegt angeregt=> nur die Moleküle in einer bestimmten Brennebene werden sichtbar=> schärferes Bild

Aminosäuren reagieren spontan über ihre Seitenketten miteinander=> bilden Fluoreszenzfarbstoff

GFP-Gen kann in Zellen-DNA eingefügt werden=> wenn exprimiert leuchtet die Zelle grün

um lebende, ungefärbte Zellen und Gewebe zu betrachten. Es wird Licht durch Probe geschickt und unterschiedliche Brechung in der Probe wird dargestellt. ist geeignet für Zeitrafferverfahren=> Zellbewegung verfolgen

ähnlich wie Lichtmikroskop aber Elektronen werden durchgestrahlt

in Hochvakuum, Schnitte müssen viel dünner sein, Schwermetalle lösen dunkles Bild aus, da sie Elektronen streuen und somit nicht dunkel auf Bild aussehen

0.1nm

für ungeschnittene Proben, Probe wird mit dünner Schicht aus Schwermetall überzogen, starker Elektronenstrahl tastet Probe ab=> Freisetzung von Sekundärelektronen, die werden auf Kathodenstrahlröhre abgebildet. Anzahl Sekundärelektronen hängt vom Auftreffwinkel des Elektronenstrahls auf die Oberfläche ab=> räumlicher Charakter der Abbildung

10nm

Vitamiine, Salze, Glucose und Serum

werden aus Gewebe wie Haut oder so entnommen, die Proteine die für Zusammenhalt wären werdn mit Trypsin (oder anderer Protease) abgebaut=> Zellen teilen sich etwa 50 mal weiter, dann endet Wachstum und sie sterben

genetische Veränderung, die es den Zellen ermöglichen sich endlos zu teilen

Zellkultur die unbegrenzt wachsen kann => unsterblich. diese Kultur wird auch als Zelllinie bezeichnet. Sind eher undifferenziert, können aber teilweise trotzdem Funktion der differenzierten Zelle ausführen

fluoreszenzmarkierte Antikörper  zur Markierung der gewünschten Zielpopulation

Dann in FACS-Gerät (fluorescence-activated cell sorting): Zellen durch Laserstrahl, die fluoreszendierenden werden von anderen Getrennt.

geeignet für Messung des DNA- und RNA-Gehaltes von Zellen und Bestimmung von Zellform und Grösse