Pflanzenzüchtung Teil 5

Next Generation Sequencing (=NGS) Techniken sind im Vergleich zu den traditionellen Sequenzierungstechniken wesentlich billiger. Man kann damit also mehr Sequenzen für weniger Geld und in kürzerer Zeit mit weniger Aufwand bestimmen.

Die Sequenzierung von Kulturpflanzengnomen hat diverse Gründe:

Die Landwirtschaft wird immer wichtiger als ein wirtschaftlicher Faktor für die wachsende Weltbevölkerung. Damit wird auch die Forschung immer wichtiger, die die Landwirtschaft auf den Bereichen der Lebensmittelsicherheit, Energieeinsparung und Umweltverträglichkeit voranbringt. 

Um bestimmte Eigenschaften von Pflanzen verbessern zu können, ist es nötig die zugrunde liegenden genetischen und funktionellen Mechanismen zu verstehen, was wiederum nur mit der DNA-Sequenz der jeweiligen Pflanzen möglich ist. Damit können dann auch die genetischen Netzwerke und Mechanismen verstanden werden, die wichtige Eigenschaften wie die Biomasseproduktion, den Ertrag, die Stresstoleranz oder die Qualität der Pflanzen beeinflussen.

Außerdem kann auf diesem Weg die Biodiversität und genetische Variation innerhalb und zwischen Spezies ermittelt und festgehalten werden. 

Angewandt wird NGS vor allem zur De novo Sequenzierung, das heißt zur erstmaligen Sequenzierung von noch unbekannten Genomen (z.B. aus genomischer

DNA, BACs, Plasmiden oder PCR-Produkten)

Es wird vor allem auch zur Resequenzierung genutzt. Dabei wird die Sequenz von Einzelindividuen, für die bereits ein Referenzgenom existiert, ermittelt, um die Unterschiede der Individuen (wie z.B. SNPs) aufzufinden.

Weitere Anwendungsgebiete sind die Transkriptomanalyse (wie z.B. Sequenzierung von ESTs oder cDNA und Alignment mit Genom), die Untersuchung der

Genregulation durch Betrachten der differentiellen Genexpression, die Metagenomik in der die mikrobielle Diversität auch nicht kultivierbarer Organismen direkt aus der gepoolten DNA aus einem bestimmten Lebensraum bestimmt wird oder die

Paleogenomik (= Sequenzierung „alter“ DNA, z.B. aus Ötzi). 

•  Die Clone-by-Clone Methode oder hierarchische Shotgun-Methode beruht auf einer Library von BAC-Klonen, deren Inserts auf einer physikalischen Karte des betreffenden Genoms kartiert sind, das heißt die Lage eines jeden Klons innerhalb des Genoms ist bekannt. Hierfür wird zuerst eine genetische Karte erstellt, indem Populationen kartiert und im Hochdurchsatz genotypisiert werden. Anschließend werden die BAC-Klone in der Library mit den kartierten Markern gescreent. Es wird ein BAC Fingerprinting durchgeführt, um mehrere BACs der richtigen Reihenfolge nach in Contigs anzuordnen. Um diese Contigs zu vergrößern, kann auch noch eine Sequenzierung der BAC-Enden oder ein wiederholtes Screening der BAC-Library durchgeführt werden. Danach werden die einzelnen BACs eines so entstandenen Minimum Tiling Path  jeweils nach der Shotgun-Methode sequenziert. Aus den vielen kleinen überlappenden Reads, die das BAC-Insert in ihrer Gesamtheit mehrfach abdecken, wird mittels Sequenzüberlappungen die Sequenz des jeweiligen Klons zusammengebaut. Anschließend werden die Sequenzen der einzelnen Klone ebenfalls durch Sequenzüberlappungen und ihrer Lage auf der physikalischen Karte zu dem gesamten Genom assembliert. Der Vorteil dieser Methode ist, dass aufgrund der physikalischen Kartierung die Assemblierung des Genoms aus den einzelnen Contigs sehr genau funktioniert und ein Referenzgenom von hoher Qualität selbst bei stark repetitiven Genomen liefert. Der offensichtliche Nachteil ist, dass die physikalische Kartierung der einzelnen Klone sehr arbeits- und zeitaufwändig ist.
• Beim Whole Genome Shotgun Sequencing hingegen wird das gesamte Genom zufällig durch Scherung, sodass eine Vielzahl unterschiedlicher Fragmente verschiedener Länge entsteht. Alle diese Fragmente, die das Genom in ihrer Summe mehrfach abdecken, werden sequenziert. Aus diesen vielen Reads wird dann durch Überlappung der Fragmente das Genom rekonstruiert. Der Vorteil der Methode ist, dass sie gegenüber der Clone-by-Clone Methode wesentlich weniger arbeitsaufwändig ist. Nachteilig ist hier jedoch, dass das entstehende Genom oftmals Lücken aufweist und die Assemblierung bei größeren Genomen oder solchen mit viel repetitiver DNA äußerst schwierig bis unmöglich wird

Insgesamt gibt es drei Strategien, um Genome strukturiert bzw. teilweise zu sequenzieren: Contig Sequencing, Targeted Chromosome Sequencing und Geneenriched Genomic Libraries. 

Beim Contig Sequencing werden nur solche Contigs sequenziert, die DNA aus genreichen Regionen enthalten. Alternativ kann man auch nur solche BAC Contigs sequenzieren, die um den zu untersuchenden Lokus herum liegen. Damit wird nur ein Teil des jeweiligen Genoms betrachtet, der möglichst viel Information entweder über viele Gene oder über einen bestimmten Lokus der von Interesse ist enthalten.  

Beim Targeted Chromosome Sequencing werden einzelne Chromosomen durch Flow Sorting heraussortiert. Dies funktioniert durch die unterschiedliche Länge der fluoreszenzgefärbten Chromosomen. Das einzelne, heraussortierte Chromosom kann dann durch Rolling Circle Replikation amplifiziert werden. Dafür werden zufällige Hexamerprimer und eine Polymerase zugegeben, die wenn sie einmal mit der

Replikation begonnen hat erst am Ende des replizierten Chromosoms wieder abfällt.

Die so gewonnene chromosomale DNA kann entweder gleich sequenziert werden, die Assemblierung der Sequenz des vollständigen Chromosoms ist aber ohne eine physikalische Karte davon wahrscheinlich schwierig. Stattdessen kann auch eine chromosomenspezifische BAC-Library  erstellt werden, von der eine physikalische Karte anfertigt wird und die BACs einzeln sequenziert werden. 

Gene-enriched Genomic Libraries reichern einen Teil der genomischen DNA gezielt an. Dafür wird die DNA zunächst fragmentiert. Die Anreicherung genreicher Sequenzen erfolgt zum Beispiel durch Methylfiltration. Dabei wird die Tatsache ausgenutzt, dass DNA die Gene enthält weniger stark methyliert ist als intergenische DNA , die somit voneinander abgetrennt werden können. Eine andere Methode zur Anreicherung ist die DNA-Reassoziationskinetik bzw. C₀t-Analyse. Dabei wird die genomische DNA zuerst denaturiert, sodass sie in Einzelsträngen vorliegt. Beim langsamen Abkühlen paaren sich die Stränge wieder, was bei repetitiven Sequenzen wie Transposons wesentlich schneller vonstattengeht als bei Single-Copy Sequenzen wie zum Beispiel Genen. Die DNA wird verdünnt, was die Reassoziation zusätzlich hinauszögert, und an eine Hydroxylapatit-Säule gebunden. Beim anschließenden

Waschen eluiert zuerst einzelsträngige DNA, bei der es sich um Single-Copy

Sequenzen handelt. Die Doppelstrang-DNA eluiert erst bei einer höheren

Phosphatkonzentration. Die jeweilige DNA-Konzentration der Elutionsfraktionen wird spektrometrisch ermittelt. Die so gewonnenen angereicherten DNA-Fraktionen die hauptsächlich Gensequenzen enthalten sollen werden dann sequenziert.  

Ein gentechnisch veränderter Organismus ist im Gentechnikgesetz folgendermaßen definiert:

Ein Organismus, mit Ausnahme des Menschen, dessen genetisches Material in einer Weise verändert worden ist, wie sie unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzen oder natürliche Rekombination nicht vorkommt; ein gentechnisch veränderter

Organismus ist auch ein Organismus, der durch Kreuzung oder natürliche

Rekombination zwischen gentechnisch veränderten Organismen oder mit einem oder mehreren gentechnisch veränderten Organismen oder durch andere Arten der Vermehrung eines gentechnisch veränderten Organismus entstanden ist, sofern das genetische Material des Organismus Eigenschaften aufweist, die auf gentechnische Arbeiten zurückzuführen sind.