Pflanzenzüchtung Teil 5

Next Generation Sequencing (=NGS) Techniken sind im Vergleich zu den traditionellen Sequenzierungstechniken wesentlich billiger. Man kann damit also mehr Sequenzen für weniger Geld und in kürzerer Zeit mit weniger Aufwand bestimmen.

Die Sequenzierung von Kulturpflanzengnomen hat diverse Gründe:

Die Landwirtschaft wird immer wichtiger als ein wirtschaftlicher Faktor für die wachsende Weltbevölkerung. Damit wird auch die Forschung immer wichtiger, die die Landwirtschaft auf den Bereichen der Lebensmittelsicherheit, Energieeinsparung und Umweltverträglichkeit voranbringt. 

Um bestimmte Eigenschaften von Pflanzen verbessern zu können, ist es nötig die zugrunde liegenden genetischen und funktionellen Mechanismen zu verstehen, was wiederum nur mit der DNA-Sequenz der jeweiligen Pflanzen möglich ist. Damit können dann auch die genetischen Netzwerke und Mechanismen verstanden werden, die wichtige Eigenschaften wie die Biomasseproduktion, den Ertrag, die Stresstoleranz oder die Qualität der Pflanzen beeinflussen.

Außerdem kann auf diesem Weg die Biodiversität und genetische Variation innerhalb und zwischen Spezies ermittelt und festgehalten werden. 

Angewandt wird NGS vor allem zur De novo Sequenzierung, das heißt zur erstmaligen Sequenzierung von noch unbekannten Genomen (z.B. aus genomischer

DNA, BACs, Plasmiden oder PCR-Produkten)

Es wird vor allem auch zur Resequenzierung genutzt. Dabei wird die Sequenz von Einzelindividuen, für die bereits ein Referenzgenom existiert, ermittelt, um die Unterschiede der Individuen (wie z.B. SNPs) aufzufinden.

Weitere Anwendungsgebiete sind die Transkriptomanalyse (wie z.B. Sequenzierung von ESTs oder cDNA und Alignment mit Genom), die Untersuchung der

Genregulation durch Betrachten der differentiellen Genexpression, die Metagenomik in der die mikrobielle Diversität auch nicht kultivierbarer Organismen direkt aus der gepoolten DNA aus einem bestimmten Lebensraum bestimmt wird oder die

Paleogenomik (= Sequenzierung „alter“ DNA, z.B. aus Ötzi). 

•  Die Clone-by-Clone Methode oder hierarchische Shotgun-Methode beruht auf einer Library von BAC-Klonen, deren Inserts auf einer physikalischen Karte des betreffenden Genoms kartiert sind, das heißt die Lage eines jeden Klons innerhalb des Genoms ist bekannt. Hierfür wird zuerst eine genetische Karte erstellt, indem Populationen kartiert und im Hochdurchsatz genotypisiert werden. Anschließend werden die BAC-Klone in der Library mit den kartierten Markern gescreent. Es wird ein BAC Fingerprinting durchgeführt, um mehrere BACs der richtigen Reihenfolge nach in Contigs anzuordnen. Um diese Contigs zu vergrößern, kann auch noch eine Sequenzierung der BAC-Enden oder ein wiederholtes Screening der BAC-Library durchgeführt werden. Danach werden die einzelnen BACs eines so entstandenen Minimum Tiling Path  jeweils nach der Shotgun-Methode sequenziert. Aus den vielen kleinen überlappenden Reads, die das BAC-Insert in ihrer Gesamtheit mehrfach abdecken, wird mittels Sequenzüberlappungen die Sequenz des jeweiligen Klons zusammengebaut. Anschließend werden die Sequenzen der einzelnen Klone ebenfalls durch Sequenzüberlappungen und ihrer Lage auf der physikalischen Karte zu dem gesamten Genom assembliert. Der Vorteil dieser Methode ist, dass aufgrund der physikalischen Kartierung die Assemblierung des Genoms aus den einzelnen Contigs sehr genau funktioniert und ein Referenzgenom von hoher Qualität selbst bei stark repetitiven Genomen liefert. Der offensichtliche Nachteil ist, dass die physikalische Kartierung der einzelnen Klone sehr arbeits- und zeitaufwändig ist.
• Beim Whole Genome Shotgun Sequencing hingegen wird das gesamte Genom zufällig durch Scherung, sodass eine Vielzahl unterschiedlicher Fragmente verschiedener Länge entsteht. Alle diese Fragmente, die das Genom in ihrer Summe mehrfach abdecken, werden sequenziert. Aus diesen vielen Reads wird dann durch Überlappung der Fragmente das Genom rekonstruiert. Der Vorteil der Methode ist, dass sie gegenüber der Clone-by-Clone Methode wesentlich weniger arbeitsaufwändig ist. Nachteilig ist hier jedoch, dass das entstehende Genom oftmals Lücken aufweist und die Assemblierung bei größeren Genomen oder solchen mit viel repetitiver DNA äußerst schwierig bis unmöglich wird

Insgesamt gibt es drei Strategien, um Genome strukturiert bzw. teilweise zu sequenzieren: Contig Sequencing, Targeted Chromosome Sequencing und Geneenriched Genomic Libraries.