Pflanzenzüchtung Teil 5

Angewandt wird NGS vor allem zur De novo Sequenzierung, das heißt zur erstmaligen Sequenzierung von noch unbekannten Genomen (z.B. aus genomischer

DNA, BACs, Plasmiden oder PCR-Produkten)

Es wird vor allem auch zur Resequenzierung genutzt. Dabei wird die Sequenz von Einzelindividuen, für die bereits ein Referenzgenom existiert, ermittelt, um die Unterschiede der Individuen (wie z.B. SNPs) aufzufinden.

Weitere Anwendungsgebiete sind die Transkriptomanalyse (wie z.B. Sequenzierung von ESTs oder cDNA und Alignment mit Genom), die Untersuchung der

Genregulation durch Betrachten der differentiellen Genexpression, die Metagenomik in der die mikrobielle Diversität auch nicht kultivierbarer Organismen direkt aus der gepoolten DNA aus einem bestimmten Lebensraum bestimmt wird oder die

Paleogenomik (= Sequenzierung „alter“ DNA, z.B. aus Ötzi). 

•  Die Clone-by-Clone Methode oder hierarchische Shotgun-Methode beruht auf einer Library von BAC-Klonen, deren Inserts auf einer physikalischen Karte des betreffenden Genoms kartiert sind, das heißt die Lage eines jeden Klons innerhalb des Genoms ist bekannt. Hierfür wird zuerst eine genetische Karte erstellt, indem Populationen kartiert und im Hochdurchsatz genotypisiert werden. Anschließend werden die BAC-Klone in der Library mit den kartierten Markern gescreent. Es wird ein BAC Fingerprinting durchgeführt, um mehrere BACs der richtigen Reihenfolge nach in Contigs anzuordnen. Um diese Contigs zu vergrößern, kann auch noch eine Sequenzierung der BAC-Enden oder ein wiederholtes Screening der BAC-Library durchgeführt werden. Danach werden die einzelnen BACs eines so entstandenen Minimum Tiling Path  jeweils nach der Shotgun-Methode sequenziert. Aus den vielen kleinen überlappenden Reads, die das BAC-Insert in ihrer Gesamtheit mehrfach abdecken, wird mittels Sequenzüberlappungen die Sequenz des jeweiligen Klons zusammengebaut. Anschließend werden die Sequenzen der einzelnen Klone ebenfalls durch Sequenzüberlappungen und ihrer Lage auf der physikalischen Karte zu dem gesamten Genom assembliert. Der Vorteil dieser Methode ist, dass aufgrund der physikalischen Kartierung die Assemblierung des Genoms aus den einzelnen Contigs sehr genau funktioniert und ein Referenzgenom von hoher Qualität selbst bei stark repetitiven Genomen liefert. Der offensichtliche Nachteil ist, dass die physikalische Kartierung der einzelnen Klone sehr arbeits- und zeitaufwändig ist.
• Beim Whole Genome Shotgun Sequencing hingegen wird das gesamte Genom zufällig durch Scherung, sodass eine Vielzahl unterschiedlicher Fragmente verschiedener Länge entsteht. Alle diese Fragmente, die das Genom in ihrer Summe mehrfach abdecken, werden sequenziert. Aus diesen vielen Reads wird dann durch Überlappung der Fragmente das Genom rekonstruiert. Der Vorteil der Methode ist, dass sie gegenüber der Clone-by-Clone Methode wesentlich weniger arbeitsaufwändig ist. Nachteilig ist hier jedoch, dass das entstehende Genom oftmals Lücken aufweist und die Assemblierung bei größeren Genomen oder solchen mit viel repetitiver DNA äußerst schwierig bis unmöglich wird

Insgesamt gibt es drei Strategien, um Genome strukturiert bzw. teilweise zu sequenzieren: Contig Sequencing, Targeted Chromosome Sequencing und Geneenriched Genomic Libraries. 

Beim Contig Sequencing werden nur solche Contigs sequenziert, die DNA aus genreichen Regionen enthalten. Alternativ kann man auch nur solche BAC Contigs sequenzieren, die um den zu untersuchenden Lokus herum liegen. Damit wird nur ein Teil des jeweiligen Genoms betrachtet, der möglichst viel Information entweder über viele Gene oder über einen bestimmten Lokus der von Interesse ist enthalten.  

Beim Targeted Chromosome Sequencing werden einzelne Chromosomen durch Flow Sorting heraussortiert. Dies funktioniert durch die unterschiedliche Länge der fluoreszenzgefärbten Chromosomen. Das einzelne, heraussortierte Chromosom kann dann durch Rolling Circle Replikation amplifiziert werden. Dafür werden zufällige Hexamerprimer und eine Polymerase zugegeben, die wenn sie einmal mit der

Replikation begonnen hat erst am Ende des replizierten Chromosoms wieder abfällt.

Die so gewonnene chromosomale DNA kann entweder gleich sequenziert werden, die Assemblierung der Sequenz des vollständigen Chromosoms ist aber ohne eine physikalische Karte davon wahrscheinlich schwierig. Stattdessen kann auch eine chromosomenspezifische BAC-Library  erstellt werden, von der eine physikalische Karte anfertigt wird und die BACs einzeln sequenziert werden. 

Gene-enriched Genomic Libraries reichern einen Teil der genomischen DNA gezielt an. Dafür wird die DNA zunächst fragmentiert. Die Anreicherung genreicher Sequenzen erfolgt zum Beispiel durch Methylfiltration. Dabei wird die Tatsache ausgenutzt, dass DNA die Gene enthält weniger stark methyliert ist als intergenische DNA , die somit voneinander abgetrennt werden können. Eine andere Methode zur Anreicherung ist die DNA-Reassoziationskinetik bzw. C₀t-Analyse. Dabei wird die genomische DNA zuerst denaturiert, sodass sie in Einzelsträngen vorliegt. Beim langsamen Abkühlen paaren sich die Stränge wieder, was bei repetitiven Sequenzen wie Transposons wesentlich schneller vonstattengeht als bei Single-Copy Sequenzen wie zum Beispiel Genen. Die DNA wird verdünnt, was die Reassoziation zusätzlich hinauszögert, und an eine Hydroxylapatit-Säule gebunden. Beim anschließenden

Waschen eluiert zuerst einzelsträngige DNA, bei der es sich um Single-Copy

Sequenzen handelt. Die Doppelstrang-DNA eluiert erst bei einer höheren

Phosphatkonzentration. Die jeweilige DNA-Konzentration der Elutionsfraktionen wird spektrometrisch ermittelt. Die so gewonnenen angereicherten DNA-Fraktionen die hauptsächlich Gensequenzen enthalten sollen werden dann sequenziert.  

Ein gentechnisch veränderter Organismus ist im Gentechnikgesetz folgendermaßen definiert:

Ein Organismus, mit Ausnahme des Menschen, dessen genetisches Material in einer Weise verändert worden ist, wie sie unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzen oder natürliche Rekombination nicht vorkommt; ein gentechnisch veränderter

Organismus ist auch ein Organismus, der durch Kreuzung oder natürliche

Rekombination zwischen gentechnisch veränderten Organismen oder mit einem oder mehreren gentechnisch veränderten Organismen oder durch andere Arten der Vermehrung eines gentechnisch veränderten Organismus entstanden ist, sofern das genetische Material des Organismus Eigenschaften aufweist, die auf gentechnische Arbeiten zurückzuführen sind.  

In der klassischen Pflanzenzüchtung kann nur auf den primären, sekundären oder tertiären Genpool zurückgegriffen werden, um die gewünschten Allele in die Pflanze einbringen zu können. In der klassischen Pflanzenzüchtung können neue Allele also nur über Kreuzung und gemeinsame Nachkommen erzeugt werden. Beim transgenen Ansatz können über die Gentechnik neben den Allelen aus den primären, sekundären und tertiären Genpools auch solche aus Genpools jenseits der Kreuzungsbarriere eingeführt werden, also aus quartären und quintären Genpools. Diese umschließen alle natürlich vorkommenden Allele oder alle künstlich erzeugten Allele. 

Ein weiterer Unterschied ist, dass in der klassischen Kreuzung die gewünschten neuen Eigenschaften/Allele über Rekombination und Selektion in das Genom einer Pflanze integriert werden. Im transgenen Ansatz wird hingegen gezielt ein ausgewähltes Gen kloniert und in die Pflanzenzelle von außen eingebracht.

Zudem ist als kleiner weiterer Unterschied anzumerken, dass Pflanzen die durch die klassische Kreuzung erzeugt werden keinen Beschränkungen unterliegen und deshalb gleich in Feldversuchen angebaut werden dürfen. Transgene Pflanzen hingegen dürfen jedoch nicht ohne Genehmigung freigesetzt werden und werden deshalb im Rahmen des Experiments in vitro oder im Gewächshaus gepflanzt. Gegenüberstellung genetisch verändert – klassisch gekreuzt:

• Spezifischer Transfer einzelner Gene ohne dass die genetische Konstitution der Akzeptorpflanze geändert wird – Umgestaltung des gesamten Genoms
• Schnell und effektiv – arbeitsaufwändig durch viele Kreuzungsexperimente über viele Jahre hinweg
• Verbreiterung der genetischen Ressourcen – eingeschränkte genetische Ressourcen durch Kreuzungsbarriere
• Nur Transfer weniger Gene pro Pflanze möglich, keine komplex vererbten Eigenschaften – Züchtung für polygen vererbte Eigenschaften möglich
• Nicht möglich ohne klassische Züchtung – Vervollständigung durch genetischen Ansatz möglich
• Genetisches Engineering ist in der Gesellschaft Mitteleuropas nicht akzeptiert 

Die bedeutendsten Methoden zur Transformation von Pflanzen sind die Infektion mit der T-DNA aus Agrobacterium tumefaciens oder der sogenannte „biollistische“ Ansatz, bei dem die Zellen mit mit DNA gecoateten Partikeln beschossen werden. 

Transformation mit A. tumefaciens:

Die Bakterien tragen ein modifiziertes Ti-Plasmid, welches in seiner T-DNA je das insertierte Gen und einen Selektionsmarker für Pflanzen trägt, die je von einem passenden Promotor auf der einen und einem entsprechenden Terminator auf der anderen Seite flankiert werden. Auf dem restlichen Ti-Plasmid befindet sich dann noch ein bakterieller Selektionsmarker für die Vermehrung in den Bakterien und die Selektion der Bakterien, die das entsprechende Plasmid tragen. Die Transformation findet in vitro statt. Die Oberfläche eines Blattes wird desinfiziert und kleine Scheiben werden daraus ausgestanzt. Diese werden auf ein Medium gegeben, wo der Callus induziert wird. Anschließend wird Agrobacterium dazugegeben und die

Pflanzenzellen und Bakterien werden co-kultiviert. Die Bakterien werden mit Hilfe ihres Selektionsmarkers selektiert, sodass nur solche die Pflanzen infizieren die das richtige Ti-Plasmid tragen. Nach der Infektion der Pflanzenzellen mit dem Ti-Plasmid wird das Wachstum des Callus zu einer Sprosse induziert und die korrekten Transformanden aufgrund des Pflanzenselektionsmarkers auf der T-DNA selektiert. Die so entstehenden Sprosse werden im Gewächshaus herangezogen bis die Samen der transformierten Pflanze geerntet werden können.  

Beim Partikelbeschuss werden ebenso kleine Scheiben eines desinfizierten Blattes in Kultur genommen und die Ausbildung eines Callus induziert. Die Pflanzenstücke werden dann mit Gold- oder Wolframpartikeln, die das gewünschte Gen tragen, mit hohem Druck beschossen, sodass die DNA-bedeckten Partikel in die Zellen eindringen.

In einigen wenigen Zellen wird die DNA in die genomische DNA eingebaut. Anschließend wird wieder das Sprossenwachstum induziert und die Transformanden selektiert. Anders als die Methode mit Agrobacterium kann diese Methode auch auf Monocotyledonen angewandt werden.  

Da Zellorganellen nur maternal vererbt werden, reicht es wenn man die Eizellen behandelt. Dafür eignet sich die Methode mit Agrobacterium nicht, weil die T-DNA nur in die DNA im Nucleus integriert wird. Entsprechend bietet sich die Particle Gun an.

Der Vorteil der Transformation von Zellorganellen ist, dass diese eben nur maternal vererbt werden. Dadurch entsteht kein Risiko, dass diese gentechnische Veränderung sich ausbreitet, weil sie nicht durch Pollen übertragen und vererbt werden kann. Damit gibt es keine Probleme mit der „Kontamination“ von anderen, nicht gentechnisch veränderten Pflanzen durch Pollen, die die gentechnische Veränderung tragen.  

• Beim Biotest werden die Pflanzen zum Beispiel mit Herbiziden behandelt. Nur die transgenen Pflanzen, die das Resistenzgen gegen das Herbizid tragen, überleben im Biotest.
• In der qualitativen PCR werden Primer die komplementär sind zu bestimmten Abschnitten des Insert-Gens bei der PCR verwendet. Diese können in der PCR Screening-Elemente wie einen Promotor, einen Terminator und den Selektionsmarker des Inserts nachweisen, konstruktspezifisch Promotor und Selektionsmarker und eingebrachtes Gen und Terminator. Sie können genspezifisch sein und nur das eingebrachte Gen nachweisen. Oder sie können eventspezifisch sein und jeweils den Übergang der Pflanzen-DNA in das Insert nachweisen. Die qualitative PCR macht eine Ja-Nein-Aussage: Ist ein PCR-Produkt vorhanden, wurde das Insert erfolgreich eingebaut. 
• In der quantitativen PCR wird neben entsprechenden Primern auch noch eine Sonde zur PCR-Reaktion gegeben, die an den Enden einen Farbstoff und einen Quencher trägt. Diese Sonde ist komplementär zu dem eingeführten Zielgen, ebenso wie die Primer. Ist das Zielgen also vorhanden, so wird es in der PCR vermehrt und die Sonde dabei durch die Polymerase abgebaut. Dadurch werden Farbstoff und Quencher räumlich getrennt, was ein Fluoreszenzsignal des Farbstoffs zur Folge hat. Anhand der Intensität der Fluoreszenz nach einer festgelegten Anzahl von Replikationszyklen kann mit dieser RealTime-PCR die Anzahl der Genkopien festgestellt werden.  Im ELISA (= Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) wird das aus dem eingeführten Gen entstehende Zielprotein mittels Antikörpern gegen dieses Protein nachgewiesen.
• In einem Sandwich-ELISA wird das Protein gebunden durch einen CaptureAntikörper und nachgewiesen durch einen Detektionsantikörper, der wiederum erkannt wird von einem Antikörper an den eine Nachweismethode wir die Meerrettich-Peroxidase gekoppelt ist. Voraussetzung dafür ist, dass das Protein im untersuchten Gewebe exprimiert wird und dass es nicht denaturiert ist, da die Antikörper sonst evtl. nicht mehr daran binden können.  

 Je weiter entfernt von den transgenen Pflanzen andere, nicht transgene Pflanzen angebaut werden, die von den Pollen der transgenen Pflanzen befruchtet werden können, desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit einer Auskreuzung. Deshalb wäre es sinnvoll, in der Umgebung von transgenen Pflanzen keine anderen Pflanzen der Art anzubauen und einen Sicherheitsabstand zwischen den Feldern einzuhalten. Eine weitere Methode der Verhinderung ist wie oben bereits besprochen, die genetische Veränderung in der DNA der Organellen einzuführen, da diese nicht über Pollen vererbt werden können.