Pflanzenzüchtung Teil 1

• F2-Nachkommenschaft: Nachkommen aus der Selbstbefruchtung einer heterozygoten F1-Pflanze -> nach weiteren Selbstbefruchtungen entsteht eine rekombinante INzuchtlinie (=RIL)
• Doppelaploide Linien (=DH): Homozygote Linien erhalten aus der Verdopplung des Genoms von haploiden Gameten wie Eizellen (=Gynogenese) oder Mikrosporen (=Androgenese)
• Rückkreuzungsnachkommenschaft (=Backcross, BC): Rückkreuzung der F1-Generation (heterozygot, homogen) mit einem der Eltern (homozygot) --> BC1

Doppelhaploide Linien werden entweder aus den weiblichen Eizellen (= Gynogenese) oder aus den männlichen Mikrosporen (= Androgenese) gewonnen. 

• Androgenese: Aussaat eines Samens, der zur Donorpflanze heranwächst  --> kurz vor der Blüte werden die Pflanzen kältebehandelt um die Blütenentwicklung zu stoppen -->  Entfernen der Staubbeutel, die auf Petrischale ausgesät und induziert werden -->Entwicklung embryoider Strukturen --> Umsetzen der Embryoiden auf regeneratives Medium --> Heranwachsen der haploiden Pflänzchen --> Verdopplung des haploiden Genoms durch Behandlung mit Colchicin (Verhindert Teilung der Chromosomen während der Mitose) --> Pflanze mit zwei mal dem gleichen Chromosomensatz (= doppelt haploid)
• Gynogenese: Entfernen der eigenen Staubbeutel --> Bestäubung der Pflanze mit Maispollen (Auslösen des Befruchtungsreizes aber nachher Eliminierung der Mais-DNA) --> Behandlung mit Wachstumsfaktoren --> Entnahme der haploiden Embryos aus Samen (ohne Endosperm => Embryo würde verhungern) --> im Dunkeln auf regenerativem Medium kultivieren --> bei Licht zu Pflänzchen heranziehen --> durch Colchicinbehandlung Verdoppelung des haploiden Genoms

Phänotyp ist

• das Erscheinungsbild eines Individuums, also ein Produkt aus Genotyp und Umwelteinflüssen.
• Der Genotyp ist dabei die Gesamtheit der genetischen Ausstattung eines Organismus. Die Genotypen können allerdings unterschiedlich gut an verschiedene Umweltbedingungen angepasst sein.
• Umweltbedingungen setzen sich zusammen aus: 
  • Licht,
  • Temperatur,
  • Wasser,
  • Fruchtbarkeit der Erde,
  • Krankheiten,
  • abiotischen Stress
  • usw.  

• Qualitative Variation wird durch nur ein einzelnes Gen beeinflusst, sodass das entsprechende Merkmal entweder vorhanden ist oder nicht (Ja-Nein-Antwort).
  • monogenische Resistenzen,
  • Verzwergung,
  • Aluminiumtoleranz,
  • Monogermie,
  • gelbe Samen (bei Raps)
• Quantitative Variation geht auf mehrere Gene zurück. Je mehr Gene für ein Merkmal beteiligt sind, desto mehr nähert sich die Verteilung der Ausprägungen des Merkmals an die Normalverteilung an. Es gibt somit eher eine kontinuierliche Abstufung bei der Ausprägung des Merkmals statt den „diskreten Zuständen“ wie bei den qualitativen Merkmalen.
  • Ertrag per Hektar,
  • Samengewicht,
  • Ernteindex,
  • Nährstoffaufnahme,
  • Photosyntheserate,
  • Proteingehalt,
  • Verdaulichkeit,
  • Back-/Kochqualität.
  • Geschmack,
  • polygene Resistenzen,
  • Winterhärte

Tabelle

• Mutationen: Entstehung von neuen Allelen entweder durch natürliche oder induzierte Mutationen (Induktion von Mutationen z.B. durch Strahlung wie Röntgenstrahlen, Chemikalien wie EMS = Ethymethansulfonat oder in Zellkultur durch somaklonale Variation)
• Rekombination: Neukombination von elterlichen Genen bei der sexuellen Reproduktion sowie durch natürliche oder kontrollierte Kreuzungen, Crossing Over 

• Allgemeine Defintion: Molekulare Marker sind DNA-Sequenzen die mit passenden Methoden detektiert werden können. Ein Marker ist ein DNA-Segment mit einer feststellbaren physikalischen Lage auf einem Chromosom, dessen Vererbung verfolgt werden kann. Ein Marker kann ein Gen sein oder ein Stück DNA ohne bekannte Funktion.
• DNA-Segmente die auf einem Chromosom nahe beieinander liegen werden zusammen vererbt. Deshalb werden Marker benutzt werden, um die Vererbungsmuster von Genen zu bestimmen, die noch nicht identifiziert wurden aber deren ungefähre Lage bekannt ist.
• Voraussetzungen hierfür sind, dass der Marker polymorph ist, das Experiment reproduzierbar und transferierbar ist. Marker müssen gleichmäßig über das Genom verteilt sein, codominant vererbt werden und schnell, einfach und billig zu detektieren sein. 

• Zur Detektion von Unterschieden zwischen Individuen (also zur Unterscheidung von unterschiedlichen Varianten einer Erntespezies oder um Ähnlichkeiten zwischen verschiedenen Spezies zu finden)
• Verfolgen der Vererbung eines molekularen Markers in einer sich aufspaltenden Population (also um eine Kopplung mit einer bestimmten Eigenschaft wie Resistenzgenen herauszufinden oder als Marker um ein bestimmtes Gen zu selektieren à Markergestützte Selektion)
• Verwendung von mehreren/vielen Markern um eine Kopplungskarte herzustellen (für Genomanalyse oder kartenbasiertes Klonieren) 

• RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphisms
  • Genomische DNA wird durch Restriktionsenzyme verdaut -> Gelelektrophorese trennt die Fragmente entsprechend ihrer Größe auf -> Übertragen der Fragmente von dem Elektrophoresegel auf eine Membran (dabei Denaturierung in basischem Puffer -> Einzelsträngige DNA-Sonde wird gelabelt (radioaktiv oder mit Biotin) -> gelabelte Einzelstrang-Sonde hybridisiert mit homologen Sequenzen -> Detektion via Autoradiographie oder Chemilumineszenz 
  • Verwendung von homologen Sonden (aus dem gleichen Organismus) oder heterologen Sonden (aus einem verwandten Organismus) ist möglich. Der Erflog der Hybridisierung ist abhängig von der Sequenzidentität zwischen Sonde und Marker ( > 70%).
  • Codominant vererbte Polymorphismen entstehen durch Hinzukommen oder Verlust von Restriktionsschnittstellen (z.B. durch Punktmutationen) oder durch Insertionen oder Deletionen zwischen zwei Restriktionschnittstellen. Selten entstehen auch dominant vererbte Polymorphismen durch größere Insertionen und Deletionen. Bei dominanter Vererbung können, falls ein Elter die gleichen Banden wie die F1-Generation aufweist, heterozygote Pflanzen von diesem Elter nicht mehr unterschieden werden. 

1. SSR = Simple Sequence Repeats

   SSR-Motive bestehen aus 1-5 Basenpaaren die 5-30mal wiederholt werden (=

   Microsatellit oder STR = Short Tandem Repeat)

   Genomische DNA wird isoliert, mit Restriktionsenzymen verdaut und in Phagen oder Plasmide kloniert. Die Klonbibliothek wird durch Mikrosatellit-Motive durchsucht, positive Klone werden sequenziert. Spezifische Primer von ca. 20 bp für die Sequenzen die rechts und links von den Repeats liegen werden entwickelt und mittels PCR vervielfältigt. Dieser Prozess kann bei bekannten Genomen auch durch Datenbanksuchen in ESTs (= Expressed Sequence Tags, partiell oder komplett sequenzierte cDNAAbschriften der mRNA einer Zelle) oder genomischer DNA nach solchen Repeats ersetzt werden. 

   Es werden die Fragmente (ca. 100-300 bp lang) per PCR amplifiziert, die die Repeats enthalten und anschließend durch SDS-PAGE oder hochauflösende

   Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Die Banden werden sichtbar gemacht durch fluoreszenzgelabelte Primer, Silberfärbung, Radioaktivität oder Ethidiumbromid. Codominant vererbte Polymorphismen entstehen durch eine variable Anzahl an Repeats, dominant vererbte eher selten durch den Verlust der Primer-Bindestelle. 

AFLP = Amplified Fragment Length Polymorphisms

Diese Methode basiert auf der selektiven Amplifikation von Restriktionsfragmenten aus den vollständigen Verdau der genomischen DNA. Zuerst erfolgt der Restriktionsverdau mit zwei Restriktionsenzymen, wovon eines eine 6 bp lange Schnittstelle hat und das andere eine 4 bp lange, sowie die Ligation von Oligonucleotid-Adaptoren zu den überhängenden Enden. In der Prä-Amplifikation erfolgt eine Vervielfältigung von Fragmenten die unterschiedliche Restriktionsschnittstellen an beiden Enden haben. Dies geschieht durch Primer ohne selektive Basen und durch die Annealingtemperatur und das Zeitfenster für die Elongation. Die kürzeren Primer für die 4bp-Site bindet nicht so gut bei höheren Annealingtemperaturen, und die langen Fragmente die die 6bp-Site an beiden Enden haben können nicht fertig amplifiziert werden wenn die Zeit der Elongationsphase nicht ausreicht. In der selektiven Amplifikation werden Primer verwendet, die zusätzlich zu den Adaptern und Restriktionsschnittstellen auch noch bis zu drei weitere so genannte selektive Basen haben. Dadurch werden nur solche Fragmente vervielfältigt, die im Anschluss an die Restriktionsschnittstellen komplementär zu den selektiven Basen sind. Die Anzahl der entstehenden Fragmente kann durch die Anzahl der selektiven Basen gesteuert werden, mit jeder selektiven Position wird die Fragmentanzahl auf ¼ reduziert.

Am Ende werden die PCR-Produkte gelabelt (mit Radiaktivität oder

Fluoreszenzfarbstoffen) und mittels PAGE oder einem automatischen Sequenzer aufgetrennt.

Dominant vererbte Polymorphismen entstehen durch das Vorhandensein oder Fehlen der Primer-Bindestellen, die selteneren codominant vererbten Polymorphismen durch Längenunterschiede der PCR-Fragmente aufgrund von Insertionen oder Deletionen. 

• SNP = Single Nucleotide Polymorphism
• SNPs sind Positionen, an denen sich die Genome von einzelnen Individuen in einer Base unterscheiden (= Punktmutationen). SNPs zeigen eine Kopplung mit der DNA, die sie umgibt, sodass ein bestimmtes SNP normalerweise in Kombination mit bestimmten Allelen für benachbarte Gene auftritt. Diese Kopplung erzeugt Haplotypen, bei denen das Auftreten eines Gens vorhergesagt werden kann durch das Vorhandensein gekoppelter SNPs. Diese Kopplung kann durch Crossing Over aufgehoben werden. Je weiter die SNP-Marker von den entsprechenden Genen entfernt liegen, desto wahrscheinlicher wird ein Crossing Over zwischen den Positionen, sodass diese Kopplung nur für benachbarte Abschnitte der DNA angenommen werden kann.
• SNPs können auftreten in folgenden Formen:
  • rSNPs: in regulatorischen Regionen (haben möglicherweise einen Einfluss auf den Phänotyp, wenn dadurch die Regulation eines Gens beeinflusst wird)
  • iSNPs: in Introns gelegen (haben möglicherweise einen Einfluss auf den Phänotyp, wenn zum Beispiel die für das Splicing nötigen konservierten Positionen betroffen sind)
  • cSNPs: in Exons (haben einen Einfluss auf den Phänotyp, wenn sie nicht synonym sind und dadurch für eine andere Aminosäure codieren)
  • sSNPs: in Exons (haben keinen Einfluss auf den Phänotyp, obwohl sie in Exons liegen, weil sie synonym sind und deshalb keine Aminosäure-Substitution nach sich ziehen)
  • gSNPs: in genomischen, nicht codierenden Sequenzen (haben keinen Einfluss auf den Phänotyp) 

• High Throughput Detection: Illumina Golden Gate Assay: Die genomische DNA wird fragmentiert und über eine Bindung an Biotin aufgereinigt. Zur Target-DNA werden allelspezifische Primer gegeben, die als letzte Base die jeweilige Base des SNP haben, sowie locusspezifische Primer, die als reverse-Primer dienen und zudem eine Adresse, also eine bestimmte Sequenz an der sie erkannt werden können, tragen. Das Stück Target-DNA wird in einer PCR amplifiziert, wenn der jeweils allelspezifische Primer daran bindet. Die genetische DNA wird über das daran gekoppelte Biotin entfernt, die durch PCR entstandenen Produkte werden durch universelle Primer in einer PCR amplifiziert.  Die PCR-Produkte können dann über ihre Adresse mit dem dazu komlementären Oligonucleotid hybridisieren, die an einem Kügelchen (=Bead) immobilisiert sind. Anhand der Adresse, die auf dem Bead war, kann der SNP dann einer Position im Genom zugeordnet werden, und die Farbe bzw. deren Mischung gibt an, ob das untersuchte Genom für dieses SNP homo- oder heterozygot ist.  

Die Wahl der Methode ist abhängig von den technischen Ressourcen sowie die Zugänglichkeit der technischen Plattformen, die Verfügbarkeit von Markern (wie viele sind überhaupt bekannt), die Anzahl der Genotypen und die Anzahl der Marker (evtl. High Throughput nötig) sowie die Kosten des Verfahrens. Außerdem werden seit neuestem immer mehr direkte Resequenzierungen mit next-generation Sequenztechniken verschiedener Genotypen durchgeführt. 

• Singe Base Extension Assay:  eine allelspezifische PCR, wobei der Primer komplementär ist zu der Sequenz direkt upstream von dem zu untersuchenden SNP, und das 3’-Ende des Primers hört genau eine Position vor dem SNP auf. Die Primer sind durch unspezifische Anhängsel unterschiedlich lang, enthalten jedoch stets eine 18-28 bp lange Sequenz die komplementär ist zur TargetDNA. Die Target-DNA wird zuerst mittels PCR amplifiziert, dann werden die jeweiligen Primer zugegeben. Das 3’-Ende des Primers wird von einer Polymerase um genau ein Abbruchnucleotid erweitert, welches ein Fluoreszentlabel trägt und komplementär ist zu der jeweiligen Base des SNP. Die Farbe des Fluoreszenzlabels gibt dann an, welche der vier Basen an dieser SNP-Position vorhanden ist. Durch unterschiedlich lange unspezifische Anhängsel an verschiedene spezifische Primer können auch Multiplex-Bestimmungen mehrerer SNPs durchgeführt werden, indem die Primer dann der Länge nach aufgetrennt werden. 
• TaqMan 5’-Nuclease Assay: Die Sequenz, die das SNP enthält, muss hierfür bekannt sein. Zu der Target-DNA wird eine TaqMan-Sonde hinzu gegeben, die komplementär ist zu der Sequenz, die das SNP umgibt, und die an einem Ende einen ReporterFluoreszenzfarbstoff und an der anderen Seite einen Quencher trägt. Diese Sonde kann an ihre Zielsequenz binden, wenn die darin enthaltene Base an der SNP-Position komplementär zu der in der Target-DNA ist, bei einem Mismatch bindet die Sonde nicht stark genug. Außerdem werden zwei PCR-Primer jeweils in einigem Abstand up- und downstream von der TaqMan-Sonde benötigt. Während der PCR hybridisiert die TaqMan-Sonde also mit der zu ihr komplementären Sequenz innerhalb des PCR-Targets. Während der PCR wird die Sonde aber durch die 5’->3’-Exonucleaseaktivität der Taq Polymerase abgebaut, wodurch der Reporterfarbstoff und der Quencher räumlich getrennt werden.-> der Einfluss des Quenchers auf den Reporter verringert, und die Intensität der Fluoreszenz nimmt exponentiell zu.  Lichtemission wird mittels eines Spektrometers am Ende der PCR bestimmt.